常压室温等离子体诱变选育春雷霉素高产菌株

高嫚妮 潘忠成 杨玉旺 杨宏勃 陈豪 翁婧 李蒲民

摘要：采用常压室温等离子体对春雷霉素生产菌株小金色链霉菌（ Streptomyces mlcroaureus） 203#进行诱变育种，采用不同时间等离子体照射诱变，再经过琼脂块筛选、摇瓶初筛和复筛，获得2株春雷霉素高产菌株，摇瓶效价分别为5012 μg/mL和4034 μg/mL，相比原始出发菌株203的效价提高了147%和98%。关键词：小金色链霉菌;效价;诱变选育;春雷霉素;常压室温等离子体中图分类号：TQ455.5

文献标识码：A

文章编号：16 74-9944（ 2019） 24-0001-04

1 引言

近年来，随着人们环保意识的加强，生物农药逐渐走人人们的视野。其专一性强，活性高，安全环保，不易产生残留和抗药性，对我国农业避免药害、合理用药、减缓病害抗药性、提高防治效果、减少农药残留有着重要意义。春雷霉素不仅能防治水稻稻瘟病[1]，对番茄叶霉病[2，3]、黄瓜细菌性角斑病[4，5]、白菜软腐病[6]等也具有抗菌作用。春雷霉素作为高效、广谱、低毒、无公害的生物农药，被农业部列为无公害农产品生产推荐农药，展示了越来越光明的市场前景。

春雷霉素是属于氨基糖苷类抗生素，其产生菌为小金色链霉菌。菌种的高产和发酵工艺的优化关系到一个发酵行业的灵魂，能获得一株高产、稳定、适应性好的菌株，将会大大缩短产业化的路程。采用等离子体诱变和紫外照射诱变是目前常采用的有效诱变手段，以此来筛选抗生素高产菌株已广泛用于菌株选育程序中[7]。多杀菌素产生菌经过紫外诱变，筛选高产菌株已有研究报道[8]。汪晨等[9]以谷氨酸棒杆菌作为原始出发菌株，通过常压室温等离子体诱变技术，确定高产琥珀酸等离子体诱变的物理参数和最佳诱变条件，筛选得到具备良好的产琥珀酸与有机酸的能力的诱变菌。蔡聪等[1O]为进一步提高凝结芽孢杆菌发酵木糖生产L一乳酸的产量和转化率，以实验室保存的一株能利用木糖产L一乳酸的野生型凝结芽孢杆菌菌株NLOI为出发菌株，通过等离子体诱变育种技术和平板菌落初筛、摇瓶复筛，最终得到一株木糖耐受力强、L一乳酸产量高、遗传特性稳定的正向突变菌株NL- CC- 17。常压室温等离子体（ ARTP）诱变筛选高乳糖酶活力乳酸克鲁维酵母的条件，以ARTP诱变育种方法为诱变手段，对乳酸克鲁维酵母进行不同时长（10 s依次增加到300 s）的诱变处理，并结合高通量筛选方法快速筛选出33株乳糖酶活力提高50%以上的突变菌株。通过复筛最终得到4株高乳糖酶活力的突变菌株[11.12]。白云[13]通过响应面的培养基的优化实现了多杀菌素发酵产量的有效变化，除菌株的高产特性外，菌株的适应环境的能力同样非常重要。

2 实验材料

2.1 实验仪器

常压室温等离子体诱变育种仪（ ARTP）：无锡源清天木生物科技有限公司;HZQ- X500C大型恒温振荡器：上海一恒科学仪器有限公司;恒温恒湿箱：上海恒一科学仪器有限公司;LC-2030高效液相色谱仪：株式会社岛津制作所。

2.2 实验菌种

春雷霉素产生菌小金色链霉菌（Streptomyces ml-croaureus），由陕西麦可罗生物科技有限公司提供。

3 实验方法

3.1 小金色链霉菌斜面培养制备和斜面孢子计数

用接种铲将出发菌株接种到斜面培养基（葡萄糖1.0%，麦芽糖0.5%，蛋白胨0.1%，氯化钠0.1%，豆饼粉5.0%，碳酸钙0.1%，琼脂2.0%，其余水，pH自然，121℃灭菌20 min）上25～30℃培养9d，获得孢子斜面，再刮下斜面全部孢子，用灭菌生理盐水稀释108倍，涂布在含培养基（同斜面培养基相同组分）平皿上，28℃培养3d，单菌落计数，依据稀释比例计算斜面孢子总数。

3.2 小金色链霉菌常压室温等离子体（ ARTP）诱变处理

用接种铲铲取整个斜面孢子，加入含10 mL生理盐水的50 mL试管中，加入40颗玻璃珠，震荡4 min，用灭菌脱脂棉过滤去除菌丝片段，制成大浓度孢子悬液。再用灭菌生理盐水稀释至孢子浓度约为106个/mL。孢子悬液中加终浓度为5%灭菌甘油，混合均匀，取10μL涂于无菌载片上，距离照射源2 mm，分别照射O s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s、120 s、130s、140 s、150 s、160 s、170 s、180 s，立即分别稀释O倍、10倍、1000倍、10000倍、100000倍，取100 μL均匀涂布于平皿上，黑暗静止培养6～10 d，获得单菌落。

3.3 春雷霉素高产菌株筛选

3.3.1 琼脂块法筛选诱变后菌株

制备双层平板，将灭菌后的下层培养基15 mL趁热倒入平板中，冷却30 min。上层培养基温度降至50℃左右，加入10%的春雷霉素指示菌枯草芽孢杆菌，轻摇混匀，取15 mL迅速铺于已制备好的下层培养基上，继续冷却至室温。用接种针挑取诱变后的单菌落，轻置于培养基上，37℃培养28 h，通过考察抑菌圈大小筛选出产春雷霉素的能力强的单菌落。

下层培养基：琼脂1. 5%，其余为水，pH自然。上层培养基组分：蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1.0%、琼脂1.5%，其余为水，pH自然。

3.3.2 摇瓶发酵法筛选诱变菌株

初筛：从平板上挑选抑菌圈大的单菌落接种至斜面培养基上，28℃培养9d，获得孢子斜面。用接种铲从斜面將孢子接种到种子培养基（豆饼粉5. 0%，饴糖0. 5%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.5%，玉米油5.0%，其余为水，pH自然）中，28℃，200 r/min摇床震荡培养培养24 h，按2% （v/v）的接种量立即转接至发酵培养基（黄豆饼粉5.0%，磷酸二氢钾0.50%，氯化钠0.5%，玉米油5.0%，其余为水，pH自然。）中，继续进行发酵培养170 h，获得含不同浓度春雷霉素发酵液。

采用高效液相色谱分析方法测定发酵液中春雷霉素的含量，所用色谱条件：5 μm ODS不锈钢柱;流动相：乙腈一1. O%SDS水溶液（体积比20：80）;流速：1.2mL/min;可变紫外检测器：波长215 nm。依据峰面积计算发酵液中春雷霉素的含量，并选取含量高于对照10%的菌株进行复筛。复筛：重复初筛操作，对初筛的高效菌株进行复筛，最终筛选出春雷霉素高产菌株。

3.3.3 春雷霉素高产菌株的传代稳定性考察

将筛选出来的高产菌株转接至斜面培养基，在28℃恒温干燥培养箱中避光培养9d，对斜面菌种再次转接至斜面培养基上，重复操作5次。分别将这六次培养获得的斜面菌株接种至种子培养基中，28℃，220 r/min摇床震荡培养培养40 h，按2% （v/v）的接种量立即转接至发酵培养基中，继续进行发酵培养170 h，获得含不同浓度春雷霉素发酵液，采用HPLC测定发酵液中春雷霉素的含量。

4 结果分析

4.1 小金色链霉菌斜面培养制备和斜面孢子计数

用接种铲将带菌斜面全部铲进10 ml_无菌蒸馏水中，经稀释涂布，菌落计数，发现一个带菌斜面含有孢子数约为2.5×10⁹个。

4.2

ARTP诱变选育高产菌株

4.2.1ARTP诱变处理春雷霉素产生菌的存活率

通过对孢子悬液不同诱变照射时间（O s、40 s、50s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s、120 s、130 s、140 s、150 s、160 s、170 s、180 s）后，孢子存活率分别为100%、1. 36%、1.27%、0.84%、0.55%、0.04%、0.01%、0. 03%、0.25%、0.55%、0.98%、1.37%、1.29%、1.04%、0.71%、0%。由此可见孢子存活率随着照射时间延长，存活率先减小在增大再减小，似马鞍形分布。

4.2.2 筛选高产菌株

通过对ARTP不同照射时间孢子培养，琼脂块及摇瓶筛选，共选出2株春雷霉素高产菌株，摇瓶效价分别为5012 U/mL和4034 U/mL，相比原始出发菌株203效价提高了147%和98%。

5 讨论

小金色链霉菌经ARTP诱变不同时间，孢子存活率均高达70%以上，且存活率呈马鞍形分布，诱变照射后的孢子悬液在含碳酸钙平皿上稀释涂布，发现单菌落形态相似，主要呈馒头型、草帽型和车轮型，且单菌落周边出现直径大小各异的透明圈。经最终琼脂块筛选和摇瓶筛选，发现单菌落的形态与单菌落发酵后发酵液的效价没有直接关系，但单菌落在含碳酸钙的培养基上培养9d后的透明圈大小与单菌落发酵后的发酵液效价在一定条件下呈正相关，但也有个例不符合此规律。实验筛选出的这两株高产菌株分别是ARTP照射60 s和140 s孢子悬液，筛选出来的。因此，对春雷霉素生产菌株孢子诱变筛选高产菌株时，优先照射时间选择60 s和140 s。

参考文献：

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收稿日期：2019-11-23

基金项目：陕西省科技厅项目（编号：2018ZKC- 173）;陕西省科技厅项目（编号：2019-PT-15）;渭南市科技局项目（编号：ZDYF- SFGG- 17 -ZSG）;渭南市工业公关项目（编号：2019ZDYF- GYGG 31）;陕西省科技厅重大项目（编号：S2018- YF-ZDNY-0199）;陕西省科协企业创新争先青年人才托举计划项目（编号：2018-1-2）

作者简介：高嫚妮（1988-），女，硕士，研究方向为应用微生物及生物医药。

通讯作者：潘忠成（1974-），男，博士，研究方向为应用微生物及生物医药。