基于代谢组学技术的宁神灵抗抑郁作用机制研究＊

蔡萧君，王 磊，颉彦鹏，蒙艳丽，许庆瑞，侯凤艳，陆振华，王旭玲

（黑龙江省中医药科学院 哈尔滨 150036）

抑郁症（depression）是一种常见的精神疾病，世界卫生组织2017 的报告显示，全世界有超过3 亿的人受到影响[1]。抑郁症极大地降低了个体的生活质量，并使其在工作、学校和家庭中表现不佳，甚至可能导致自杀，其源自社会、心理和生物因素的复杂交互作用[2,3]。尽管对抑郁症的研究广泛，但针对抑郁症的分子生物学机制仍知之甚少。目前，抑郁症的诊断主要依赖于精神科医师对症状群的主观识别，导致误诊率高[4-6]。由于缺乏客观的诊断方法，只有不到一半的抑郁症患者（在许多国家，只有不到10%）接受有效的治疗[7,8]。因此，抑郁症的客观诊断方法将具有相当的临床价值。

宁神灵由黑龙江省中医药科学院国医大师张琪研制，用于头昏头痛、心烦易怒、心悸不宁、胸闷少气、少寐多梦，具有舒肝开郁，镇惊安神之效，具有直接调节神经功能，营养神经细胞及减轻神经细胞膜性损害的临床有效药物[9-12]，曾获得布鲁塞尔尤里卡国际发明博览会银奖。但基于中药多成分多靶标的作用机制和特点，采用有限的检测技术及方法难以进行全面的表征，这使得中药的有效性、体内药效物质基础和作用机制的相关说明受到极大限制。本研究首次采用代谢组学技术探讨宁神灵已报到有效成分的体内作用靶标及代谢机制，为宁神灵的新药研发和抑郁症靶向研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

TripleTOF 5600+LC/MS/MS 系统（美国AB SCIEX 公司）；ML-T 分析天平（瑞士梅特勒托利多）；VDUPL超纯水机（九方沃德科技有限公司）；Morri 水迷宫（安徽淮北正华生物仪器有限公司）；宁神灵颗粒由黑龙江省中医研究院制药厂提供（批准文号：国药准字Z20055040）。

表1 尿液UPLC流动相梯度洗脱方法

1.2 动物

雄性SD大鼠，体重170-220 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。实验开始前大鼠在动物室适应7 d，给予标准实验室水和食物喂养，动物室保持温度22-26℃和相对湿度50 ± 5%，光/暗12循环。

1.3 动物分组及代谢样本制备

30只SD大鼠随机分为3组，即空白组、模型组、宁神灵组。参考CUMS 模型建立方法[13]，给予18℃游泳10 min，4℃环境下1 h，束缚1 h，3 h 循环光照，光照过夜，周期42 d。空白组和模型组给予生理盐水（0.3 mL）和自由饮食，宁神灵组于应激2 周后给予5 g/kg/d的宁神灵药液。实验第43 天早收集夜尿12 h，在4℃下以转速13000 rpm·min-1离心10 min，取上清液置于EP管中，于-80℃下保存，进样前再次按上述参数离心过0.22 μm滤膜作为代谢物供试品溶液。

1.4 SD大鼠Morris水迷宫测试

1.4.1 定位航行实验

实验阶段隔1 星期进行1 次水迷宫适应性实验，实验第43 d 正式进入定位航行实验，记录各组大鼠找到平台花费时间。

1.4.2 空间探索实验

定位航行后进行空间探索实验，撤出水中平台，记录大鼠1 min 内穿越平台的次数和其在附近逗留的时间。

1.4.3 糖水偏爱率实验

大鼠禁食24小时候，给予1%的蔗糖水溶液，同时再次禁食。消耗量百分率（%）=实验前瓶体总质量-实验后瓶体总质量/实验前瓶体总质量×100%。实验周期1 h。

1.5 代谢数据采集

色谱柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3（100 mm×2.1 mm i.d., 1.8 μm）（Waters 集团公司，美国）；流动相A 为0.13%甲酸-水，B 为0.1%甲酸-乙腈；柱温：40℃；流速：0.4 ml/min；进样量：3 μL；梯度洗脱方法见表1。离子喷雾电压：5.5 KV；离子源温度：600℃；解簇电压（DP）：100 V；碰撞能量（CE）：35 eV。氮气为雾化气和辅助气：雾化气55 psi，辅助气55 psi，气帘气35 psi。在m/z 在100-1200 amu 质量范围进行全扫描，积累时间250 ms。IDA 采用标准：每个分析物，超过100 cps的八个最强的碎片离子在100-1200 amu 质量范围内进行子离子扫描，累积时间为100 ms。碰撞电压差为15 eV，动态背景扣除DBS。

1.6 数据处理

动物行为学数据采用SPSS 18.0 的Student's TTEST 分析比较组间差异，以P＜0.05 为标准进行分析；代谢数据获取和处理分析采用PeakView®2.1 软件、MasterView 软件和ProgenisisQI 1.0 软件。工作站为Analyst®TF1.6 软件。筛选标准为VIP 大于1、TTEST ＜0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫结果

2.1.1 定位航行能力结果

与空白组相比，模型组大鼠定位平台时间显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，宁神灵组定位平台的时间明显减少（P＜0.05），见表2。结果说明模型组大鼠定位能力下降，给予宁神灵后有显著治疗作用。

2.1.2 空间探索能力结果

与空白组相比，模型组大鼠的穿越平台次数和靶象限停留时间明显减少（P ＜0.05），与模型组比较，宁神灵汤组平台穿越次数和靶象限停留时间明显增加（P＜0.05），见表3。结果说明宁神灵能够一定程度地改善抑郁症。

2.1.3 大鼠糖水偏爱率实验结果

模型制备过程中每隔1周测定一次蔗糖水消耗结果。模型组显著低于空白组，说明模型建立成功。宁神灵组优于模型组，但与空白组比较无明显差异，结果见表4。

表2 各组大鼠水迷宫定位航行结果

表3 各组大鼠空间探索能力结果

表4 抑郁症大鼠蔗糖水消耗结果

2.2 代谢组学研究

本部分基于AB TripleTOF 5600+LC/MS/MS 高分辨质谱技术对抑郁症大鼠模型尿液进行代谢指纹分析。将海量的代谢数据带入最新代谢组学生物信息处理软件Progenesis QI（Waters 集团公司，美国）进行数据预处理。通过峰对齐、归一化、去噪平滑、降维后的数据带入EZinfo 3.0（Waters 集团公司，美国）进行模式识别分析（图1）。从对分组影响最大的二维数据中可知，空白组和模型组组内聚类良好、组间差异明显，宁神灵组处于两组间，且整体趋势和代谢轮廓与空白组相一致。证明宁神灵组SD 大鼠的机体状态已向健康发展，由此推断，宁神灵对抑郁症有很好的治疗作用。进一步采用偏最小二乘判别分析筛选对分组贡献最大的小分子代谢产物（图4），结合Progenesis QI内嵌标准品数据库鉴定与抑郁症相关的11 个尿液生物标记物（见表5）。分别是苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸脯氨酸、泛酸、二羟基丙酮磷酸盐、3-羟基丁酸、肌酐、腺苷。代谢通路图如图3所示。经组学代谢通路富集分析（图2）可知其主要涉及①丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢，②甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，③泛酸和辅酶A 生物合成，④赖氨酸降解，⑤苯丙氨酸代谢，⑥赖氨酸生物合成，⑦氨基酰基-tRNA生物合成。

表5 抑郁症大鼠尿液生物标志物详表

图1 空白组、抑郁症组及宁神灵组的2D得分图

3 讨论

本文首次采用代谢组学技术对抑郁症大鼠进行研究，在确定尿液生物标记物的同时，评价宁神灵的治疗作用。从抑郁症代谢机制研究结果发现，氨基酸代谢、能量代谢等与抑郁症密切相关。

图2 抑郁症大鼠代谢通路富集分析结果

氨基酸代谢紊乱在之前的已有报道，如重度抑郁症患者的血浆[14]和不同脑区（包括抑郁症大鼠模型皮质、海马和下丘脑）中已得到证实[15]。本实验中，苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸均显著下调，而甘氨酸在抑郁大鼠小脑中明显上调，提示动物的能量代谢功能失调。相反，抑郁症大鼠小脑中相关的糖酵解和TCA 循环代谢物，包括泛酸、肌酐和3-羟基丁酸均减少。肌酐是肌酸和磷酸肌酸的非酶副产物，肌酸-磷酸肌酸系统对细胞能量传输至关重要。抑郁症大鼠小脑中这些代谢物的较低水平可能表明能量缺乏，这是疲劳的重要因素，同样是重度抑郁症患者最常见的症状之一[16]。根据终产物反馈诱导和中间体介导的前馈诱导机制[17]，这里观察到的糖酵解和TCA 循环酶的变化可能是由抑郁症大鼠中这些受抑制的代谢物水平的降低所诱导的。

图3 抑郁症大鼠模型尿液代谢通路示意图

抑郁大鼠小脑中相关的糖酵解和TCA 循环代谢物，包括泛酸、磷酸二羟丙酮（DHAP）、肌酐和3-羟基丁酸均减少。肌酐是肌酸和磷酸肌酸的非酶副产物，肌酸-磷酸肌酸系统对细胞能量传输至关重要。这些代谢物在抑郁大鼠小脑中的较低水平可能表明能量缺乏，这是疲劳的重要因素，是抑郁症患者最常见的症状之一。根据终产物反馈诱导和中间体介导的前馈诱导机制，在抑郁大鼠中观察到的糖酵解和TCA 循环酶的变化可能是由于这些受抑制的代谢物水平降低所致。

腺苷是ATP 生物合成的重要底物，在抑郁大鼠的小脑中增加。有研究表明腺苷对小鼠的抗抑郁作用[18]。然而这种效应是否与ATP 生物合成有关，还需要进一步研究。本次结果发现在腺苷催化ATP 生物合成中三种酶：腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）、ATP 合成酶和Na+、K+-ATPase。APRT 催化形成AMP的补救反应。ATP 合成酶将跨膜质子转运与ADP 和无机磷酸盐合成ATP 偶联。Na+，K+-ATPase 以高浓度存在于脑细胞膜中，消耗了大约40%-50%的脑组织产生的ATP，在抑郁大鼠海马突触浆膜中其活性显著降低。腺苷、APRT 和ATP 合成酶水平的升高与Na+、K+-ATPase 的平行下调共同提示抑郁大鼠小脑ATP生物合成过程被激活。

图4 基于Progenesis QI平台的苯丙氨酸的二级鉴定结果

本研究通过小柴胡汤有效成分黄芩苷及黄芩素药物配体的特定结构，采用代谢组学探究抑郁症大鼠体内代谢机制及评价宁神灵的治疗作用。通过代谢通路富集分析可知抑郁症大鼠体内代谢主要涉及氨基酰基-tRNA 生物合成、氮代谢、硫胺素代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、嘌呤代谢、苯丙氨酸代谢、赖氨酸降解、酮体的合成与降解、精氨酸与脯氨酸代谢、生物素代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、氰氨基酸代谢、丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸代谢、泛酸和辅酶A 生物合成、β-丙氨酸代谢、糖酵解或糖异生、甘油酯代谢、丙酮酸代谢、赖氨酸生物合成、甲烷代谢、萜类醌泛醌和其他生物合成、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢、肌醇磷酸代谢、丁酸代谢、半乳糖代谢、烟酸酯和烟酰胺代谢、初级胆汁酸生物合成、果糖与甘露糖代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、戊糖和葡糖醛酸盐相互转化、嘧啶代谢、酪氨酸代谢、卟啉与叶绿素代谢。通过高通量质谱技术获取抑郁症大鼠体内生物学信息，并采用无监督模式识别方法进行分析可全面快速的明晰抑郁症的发病机制，为中药抗抑郁的作用机制研究及宁神灵抗抑郁药效物质基础研究奠定机制。