网络药理学筛选天麻素防治糖尿病的分子机制

罗竹，杨欣 冯俐 李亚辉 吕润霖 韩彩瑶 邓万娟 李专 张鹏飞

【摘 要】 目的：基于網络药理明确天麻素发挥药理作用的分子机制。方法：天麻素化学结构基于中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）下载，靶标蛋白筛选基于SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库，基于DAVID数据库对靶点进行生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MF）进行分析，100个靶标通过STRING进行相互作用分析， 基于Cytoscape 3.5.1中的Cytohubba模块筛选出关键基因。结果：天麻素筛选出100个靶点，共参与102条通路（P<0.05）;主要参与one-carbon metabolic process（碳代谢过程）、response to drug（药物反应）、proteolysis（蛋白水解）等生物过程;主要存在plasma membrane（质膜）、melanosome（黑素体）、dendrite cytoplasm（树突细胞质）等细胞成分;分子功能上，100个靶点主要有insulin receptor substrate binding（胰岛素受体底物结合）、phosphatidylinositol 3-kinase binding（磷脂酰肌醇3-激酶结合）等，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH ）为关键靶点。通过分子对接明确天麻素与GAPDH有较强的结合活性（Total-Score=7.5）。结论：初步明确天麻素调节的靶点，为动物、细胞实验提供理论依据。

【关键词】 天麻素;网络药理学;通路分析;功能分析

【中图分类号】R966 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）21-0026-06

Screening Molecular Mechanisms of Gastrodin in Prevention and Treatment of

Diabetes Mellitus base on Network Pharmacology

LUO Zhu  YANG Xin* FENG Li Li Yahui LV Runlin HAN Caiyao DENG Wanjuan LI Zhuan ZHANG Pengfei

Guizhou University of Traditional Chinese medicine，  Guiyang  550025，China

Abstract：Objective To screen the molecular mechanism of Gastrodin in pharmacological action based on network pharmacology. Methods Chemical structure of  Gastrodin based on TCMSP download， Screening of target proteins based on SwissTarget Prediction database， biological process， cellular component and molecular function of target based on DAVID database， 100 targets were analyzed by STRING and key genes were screened based on Cytohubba in Cytoscape 3.5.1. Results Gastrodin screened out 100 targets and participated in 102 pathways （P<0.05）， There are mainly plasma membrane， melanosome， dendrite cytoplasm and other cellular components; insulin receptor substrate binding， phosphatidylinositol 3-kinase binding etc; In molecular function， 100 targets are mainly involved in participate in biological processes such as one-carbon metabolic process， response to drug， proteolysis etc; GAPDH， CASP3， MAPK1 and MGAM are key targets.The binding activity of gastrodin to GAPDH was confirmed by molecular docking（Total-Score=7.5）. Conclusion The target of gastrodin regulation was preliminarily identified to provide theoretical basis for animal and cell experiments.

Keywords：Gastrodin; Network Pharmacology; Pathway Analysis; Functional Analysis

天麻（Gastrodia elata BL.） 为贵州道地药材，是常用而较名贵的中药材，临床应用广泛，在头痛眩晕、癫痫、小儿惊风等方面发挥重要作用[1]。主要含有：香荚兰醇、香荚兰醛、天麻素、多糖等化学成分，其中天麻素（gastrodin）含量最高[2]。天麻素药理作用广泛，毒副作用较，现代药理学研究表明，天麻素在心血管疾病、糖尿病、神经疼痛、帕金森病等有较好的治疗效果[3-4]。已经有文献表明：天麻素注射液、天麻素联合丹红注射液、天麻醇提物、乙酰天麻素等在糖尿病及其并发症中发挥作用[5-6]，但是作用机制尚未明确，为了进一步明确天麻素防治糖尿病调节的靶点，本研究采用网络药理方法，筛选天麻素作用的靶点，对其靶点进行通路分析、GO（Gene Ontology）功能注释、相互作用分析等，明确天麻素防治糖尿病的分子机制。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件 STRING（https：//stringdb.org/）;DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）; Cytoscape 3.5.1软件（http：//www.cytoscape.org）;KOBAS3.0（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php）;軟件运行于 Windows 操作系统平台下，使用的相关软件已授权或开源软件。

1.2 天麻素靶标蛋白筛选 天麻素的mol2结构基于中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology ，TCMSP）[7]下载，采用SYBYL对薏苡仁化合物加氢、加电荷，每个化合物进行能量优化。采用靶标蛋白筛选基于Swiss Target Prediction（http：//www.swisstarge-tprediction.ch/）数据库，根据化学成分的2D 和 3D结构进行预测。可以预测五种不同来源的生物，基于Daylight FP2的分子指纹方法，并采用了Tanimoto系数定义的相似度度量方法。通过Swiss Target Prediction进行靶标预测，在线打开Swiss Target Prediction，在Choose an organism一栏中选择Homo sapiens。输入天麻素化学成分的SMILES，筛选天麻素靶标蛋白。

1.3 天麻素靶标蛋白生物功能分析 靶点GO功能分析基于DAVID 6.8（DAVID 6.8，https：//david. ncifcrf.gov/）在线分析，将100个靶点导入DAVID数据库，点击限定物种为人源，设定阈值P<0.01，GO注释分析包含，即细胞组分（cellular component，CC）、生物过程（biological process，BP）以及分子功能（molecular function，MF）。

1.4 天麻素靶标蛋白靶标通路分析及ggplot 2构建网络模型 基于KOBAX3.0（KEGG Orthology Based Annotation System）对天麻素靶标蛋白进行通路富集分析，共有表达差异基因通过数据库整合到相应的Pathway条目。结果得到靶标蛋白参与的所有途径，筛选靶标蛋白显著参与的途径（P≤0.01），通过Rstudio中的ggplot 2输出top 20通路，显示通路名称、Rich factor、富集分析的P值和Q值等。

1.5 靶标蛋白相互作用分析 基于STRING对天麻素靶标蛋白进行相互作用分析，物种设为“Homo sapiens”（人源），下载string_ interactions.tsv文件，导入Cytoscape 3.5.1软件，基于 Cytoscape 3.5.1 软件中的的Cytohubba模块筛选关键靶点[8-9]。

1.6 分子对接及关键氨基酸位点 采用Surflex-Dock 模块完成分子对接研究[10]。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（1U8F）从蛋白质晶体结构数据库RCSB  （http：//www.rcsb.org/pdb ） 获取 3D 晶体结构[11]。基于Surflex-Dock 模块完成分子对接研究（标准模式）。选择配体（Ligand）模式产生活性口袋;其他参数均采用 SYBYL默认值，筛选结果以Total-Score>5为阈值[12]。基于Ligplot 对天麻素和GAPDH进行相互作用分析。

2 结果

2.1 天麻素靶点GO功能注释分析 基于DAVID对天麻素靶点进行GO注释分析（表1），生物过程中，100个靶点主要参与one-carbon metabolic process（碳代谢过程）、response to drug（药物反应）、proteolysis（蛋白水解）;主要存在plasma membrane（质膜）、melanosome（黑素体）、dendrite cytoplasm（树突细胞质）等;分子功能上，100个靶点主要有insulin receptor substrate binding（胰岛素受体底物结合）、phosphatidylinositol 3-kinase binding（磷脂酰肌醇3-激酶结合）等分子功能。

2.2 天麻素靶標蛋白通路分析 采用DAVID 数据库对天麻素靶点进行通路富集分析，100个靶标蛋白显著参与102条通路途径（P<0.05），采用R语言的ggplot 2输出20条通路（图1），其中包括胰岛素信号通路（Insulin signaling pathway）、TNF信号通路、胰岛素抵抗等，详见表2。

2.3 天麻素靶标蛋白相互作用分析 基于Cytoscape 3.5.1中的Cytohubba模块，对100个靶标基因进行相互作用分析，根据degree（度）的大小，输出前30个靶标基因（表3），颜色越深，靶点越重要。100个靶标蛋白中GAPDH为最关键靶点。

通过靶点相互作用分析，发现GAPDH为核心靶点，将采用分子对接进一步研究。天麻素与GAPDH形成4个氢键：Asp 35，Arg 16，Thr 99，Ser 122;天麻素与氨基酸Phe 37，Ser 98，Gly 100，Ile 14，Gly 12，Pro 191和Ile 38形成疏水作用（图2）。

2.4 分子对接及氨基酸位点分析 利用 Surflex-Dock 分子对接模块的 Total-Score 打分函数对小分子与靶标蛋白相互作用进行评分，Total-Score值愈大，说明小分子化合物与大分子蛋白质的匹配结合作用越好。天麻素与GAPDH分子对接结果为Total-Score=7.5，进一步验证靶点相互作用的结果。说明天素与GAPDH有较强列的结合。

3 讨论

天麻素药理作用广泛，具有较好的应用前景[13]。已经文献[14-15]表明：天麻素在脑缺血再灌注损伤、短暂性脑缺血、眩晕症等多种疾病中发挥较好的治疗效果。通过分子对接发现天麻素与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH ）有较好的结合（Total-Score=7.5），GAPDH参与能量代谢，同时也具有其他生理功能，与糖尿病密切相关。GAPDH在多种组织和细胞中表达。Min等[16]研究表明：GAPDH通过激活磷酸酶的活性对胰岛素通路具有调节作用;同时由于糖尿病引起的视网膜病变、血管内皮组织的损伤等并发症的发生与GAPDH关系密切。GAPDH为多功能蛋白，目前，对机体的生理和病理状态下的作用值得深入的研究。对于开发GAPDH的抑制剂和诱导剂有较好的应用前景，尤其是GAPDH与胰岛素通路关系密切，为糖尿病的防治提供一个崭新的药理靶向。

已有文献[17]证实天麻素具有防治糖尿病的作用。白永等人通过免疫组化、蛋白印记、PCR等技术明确天麻素可以降低胰岛素抵抗的同型半胱氨酸的含量;Sun等[18]观察天麻素对STZ诱导痛性糖尿病神经病变（PDN）的实验动物模型的作用。对糖尿病引起的瞬态钠电流、钾电流有一定的对抗作用。目前，天麻素作用的靶点尚未完全明确，本研究通过分子对接发现GAPDH为天麻素核心靶点，通过分子对接发现天麻素与GAPDH有较好的结合。而且明确Phe37、Ser98、Gly100、Ile14、Gly12、Pro191、Ile38为关键氨基酸位点。可以推测这些残基就是 GAPDH的重要残基，其在决定酶的催化特性中起到了重要作用。

基于DAVID对天麻素调节的靶点进行通路分析，包括胰岛素信号通路、TNF信号通路、胰岛素抵抗等与糖尿病发生、发展密切相关的通路。目前，天麻素药理作用的研究尚未全面、系统的分析，本研究采用网络药理学筛选天麻素调节的靶标蛋白，对靶标蛋白进行功能分析、通路分析、蛋白相互作用分析，最后采用分子对接技术验证天麻素与关键靶点的结合，明确其发挥药理作用的分子机制，从而为天麻素的应用及天麻制剂开发奠定基础。

参考文献

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（收稿日期：2019-08-14 編辑：程鹏飞）