UPLC-MS/MS法同时检测大鼠血浆伊马替尼及其代谢物

黄 曦，章利亚，郑宇红，肖仲祥

0 引言

甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)为苯氨嘧啶的衍生物，属新型酪氨酸蛋白激酶抑制剂。伊马替尼对酪氨酸激酶中的BCR-ABL抑制作用较为突出，IC50值可达207 nmol/L[1]。甲磺酸伊马替尼是最早用于治疗慢性髓性白血病(CML)的药物，目前其不仅是治疗慢性期、急变期或加速期CML和复发或转移性胃肠间质瘤(GIST)的一线用药，还可以用于治疗费城(Ph)染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(ALL)、c-Kit 突变或扩增的晚期黑色素瘤、慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)、高嗜酸性粒细胞综合征(HES)、伴巨大淋巴结肿的窦性组织增生症、晚期隆突性皮肤纤维肉瘤等[2]。伊马替尼口服生物利用度高，可达98%，主要经肝微粒体细胞色素P450中的CYP3A4代谢，循环中主要的活性代谢物N-去甲基哌嗪衍生物显示出比母体药物伊马替尼更高的活性。

目前已有文献报道大鼠血浆伊马替尼的测定方法，但鲜有同时测定伊马替尼及其代谢物的文献报道。因此，本研究拟建立一种快速、灵敏、专属性强的UPLC-MS/MS 法同时检测伊马替尼及其代谢物血药浓度，为研究伊马替尼与其他药物的相互作用和临床合理用药提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 试剂 甲磺酸伊马替尼(美国Sellect Chemicals LLC，批号：S102606，纯度：>99%)，N-去甲基伊马替尼对照品(中国食品药品检定研究院，批号：A8029，纯度：>99%)，卡马西平对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0142-9503，纯度：>99%)，HPLC色谱级乙腈，甲醇，甲酸。

1.2 仪器 超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(美国Waters公司)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；Milli-Q A10超纯水系统(美国Millipore公司)；涡旋混合器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；电子分析天平(上海方瑞仪器有限公司)。

1.3 主要试剂的配制 精密称取甲磺酸伊马替尼标准品和N-去甲基伊马替尼标准品5 mg 于50 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，混匀，各得浓度为 100 μg/ml的甲磺酸伊马替尼标准品和N-去甲基伊马替尼标准品储备液。精密称取卡马西平标准品1 mg置于10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解定容至10 ml，混匀，得到浓度为100 μg/ml的卡马西平标准品储备液，用微量移液枪准确移取100 μg/ml卡马西平储备液1.0 ml于100 ml容量瓶中，甲醇稀释并定容至100 ml，混匀，得浓度为1 μg/ml卡马西平内标储备液。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，particle size，Waters Corp.)。流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脱：0～0.5 min，40%→85%A；0.5～1.3 min，85%A；1.3～1.5 min，85%→40%A；1.5～2.5 min，40%A。流速：0.4 ml/min，柱温：40 ℃。

2.2 质谱条件 电喷雾离子化源(ESI)，正离子检测模式。定量分析的离子反应分别为：伊马替尼：m/z494.3/394.2，N-去甲基伊马替尼：m/z480.2/394.2，内标卡马西平：m/z237.1/194.2。毛细管电压：2 kV；伊马替尼、N-去甲基伊马替尼和卡马西平的锥孔电压分别为55、40、40 V，碰撞电压分别为30、30、20 V；离子源温度：150 ℃；去溶剂化温度：500 ℃；本仪器用氮气作去溶剂化气体(800 L/h)以及锥孔气体(50 L/h)。

2.3 血浆样品处理方法 将保存于-80 ℃冰箱的血浆样品置于室温下解冻并涡旋混匀，取100 μl于1.5 ml的EP管中，加入乙腈溶剂200 μl来沉淀蛋白，再加入1 μg/ml卡马西平甲醇溶液20 μl，并涡旋混匀2 min，置于4 ℃的离心机中，调节转速为13 000 r/min，离心10 min，取上清100 μl与100 μl超纯水(1∶1)稀释混匀，2 μl的稀释液注入UPLC-MS/MS 系统进行分析检测。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性 在上述色谱和质谱条件下，经 UPLC-MS/MS 检测分析测得色谱图(结果见图1)。由图1可见，在本实验条件下，各物质之间不产生相互干扰，伊马替尼、N-去甲基伊马替尼与内标卡马西平分离良好，血浆中也无内源性物质干扰目标物质出峰，方法专属性良好；伊马替尼的出峰时间为0.38 min，其活性代谢产物N-去甲基伊马替尼的出峰时间为0.36 min，内标物卡马西平的出峰时间为0.72 min。

2.4.2 线性关系及定量下线 配制浓度分别为 20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/ml 9个浓度梯度的伊马替尼血浆标准溶液和浓度分别为1、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/ml 9个浓度梯度的N-去甲基伊马替尼血浆标准溶液，按“2.3”项下处理后进样检测，测定伊马替尼峰面积As1、N-去甲基伊马替尼峰面积As2及内标卡马西平峰面积Ai。以 As1/Ai为纵坐标(y1)、伊马替尼对应的各点浓度为横坐标(x1)绘制标准曲线，得到伊马替尼的标准曲线回归方程为y1=0.000 3 x1+0.036 3，r2=0.999 2，线性范围为20～10 000 ng/ml，定量下限为20 ng/ml。以As2/Ai为纵坐标(y2)、N-去甲基伊马替尼对应的各点浓度为横坐标(x2)绘制标准曲线，得到N-去甲基伊马替尼的标准曲线回归方程为y2=0.000 07 x2+0.000 2，r2=0.999 5，线性范围为1～1 000 ng/ml，定量下限为1 ng/ml。

2.4.3 精密度试验 取大鼠空白血浆，分别配制低、中、高3个浓度梯度的伊马替尼血浆标准品溶液(50、1 000、10 000 ng/ml)和低、中、高3个浓度梯度的N-去甲基伊马替尼血浆标准品溶液(20、100、1 000 ng/ml)，每种浓度6份样品，按“2.3”项下处理后，并分别在同一天内和连续3 d内进样检测，分别计算两者的日内、日间精密度，见表1。

2.4.4 提取回收率试验 取大鼠空白血浆，按“2.4.3”项下操作分别配制3个浓度梯度的伊马替尼空白血浆标准品溶液、N-去甲基伊马替尼空白血浆标准品溶液，每种浓度6份样品，按“2.3”项下处理后进样检测，记录相应浓度伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的峰面积，即为血浆标准品的峰面积。同时取上述各相对应浓度的伊马替尼纯标准品溶液和N-去甲基伊马替尼纯标准品溶液进行分析，记录相应浓度伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的峰面积，即为纯标准品的峰面积。提取回收率=血浆标准品峰面积/纯标准品峰面积×100%，结果见表2。

图1 伊马替尼及N-去甲基伊马替尼的UPLC-MS/MS色谱图

药名加入量(ng/ml)日内测得量(ng/ml)RSD(%)日间测得量(ng/ml)RSD(%)伊马替尼5049.04±4.739.6448.34±0.621.281 0001 094.02±78.017.131 092.37±16.421.5010 00010 732.65±936.358.7210 772.65±173.031.61N-去甲基伊马替尼2020.33±2.2911.2720.22±0.160.77100112.81±8.677.68104.97±7.006.671 0001 072.86±92.448.621 063.24±11.651.10

表2 UPLC-MS/MS 法测定血浆标准品溶液中伊马替尼及代谢物的回收率

2.4.5 稳定性实验 取大鼠空白血浆，分别配制低、中、高3个浓度梯度的伊马替尼空白血浆标准品溶液(依次为50、1 000、10 000 ng/ml)和低、中、高3个浓度梯度的N-去甲基伊马替尼空白血浆标准品溶液(依次为20、100、1 000 ng/ml)，每种浓度24份样品，等分为4组，分别置于以下4个环境处理：①室温(25 ℃)12 h，②自动进样器(4 ℃)中12 h，③3次冻融，④-20 ℃ 12 d。按“2.3”项下处理。结果RSD均<15%，表明血浆样品中伊马替尼和N-去甲基伊马替尼可以被准确测定。

2.4.6 基质效应考察 取大鼠空白血浆，分别配制低、中、高3个浓度梯度的伊马替尼空白血浆标准品溶液(依次为50、1 000、10 000 ng/ml)和低、中、高3个浓度梯度的N-去甲基伊马替尼空白血浆标准品溶液(依次为20、100、1 000 ng/ml)，每种浓度6份样品，经“2.3”项处理后，在同一日内用UPLC-MS/MS检测，记录相应浓度的伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的峰面积，即为血浆标准品峰面积(A)；另配制上述低、中、高3种浓度梯度的伊马替尼甲醇标准品溶液和上述低、中、高3种浓度梯度的N-去甲基伊马替尼甲醇标准品溶液，直接进样检测，记录相应浓度的伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的峰面积，即为纯标准品的峰面积(B)。计算不同浓度血浆标准品峰面积与纯标准品峰面积的比值，即基质效应=A/B×100%。伊马替尼低、中、高3个浓度的平均基质效应分别为86.44%±10.29%、89.15%±7.74%、97.06%±7.27%；N-去甲基伊马替尼低、中、高3个浓度的基质效应分别为96.08%±3.52%、101.64%±3.25%、93.95%±4.58%。

3 讨论

关于血浆伊马替尼的药物浓度检测，目前国内外文献报道的测定方法主要有HPLC法[3-6]、LC-MS/MS法[7]、HPLC-MS法[8]、HPLC-MS/MS法[9-10]等。伊马替尼大鼠灌胃以后，伊马替尼血药浓度较高，所以采用沉淀蛋白法作为血浆样品预处理方法，不仅操作简便，而且伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的回收率也较高(均>87%)。选用的流动相由乙腈和0.1%甲酸配制，具有较好的分离度和响应。本研究建立的超高效液相色谱-串联质谱法同时检测大鼠血浆中伊马替尼及其活性代谢产物N-去甲基伊马替尼的方法，色谱峰单一、精确度高，检出限低，总分析时间仅需要2.5 min，可达到快速分析的目的，非常适合用于研究伊马替尼及其活性代谢产物N-去甲基伊马替尼的药代动力学及与其他药物之间的相互作用。