基于系统药理学探究冠心Ⅱ号方治疗冠心病的作用机制＊

杨文娜，徐文华，徐香梅，陈 旋，郑景辉

（1.广西中医药大学 广西 南宁530200；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁530011）

近年来，冠心病（coronary heart disease，CHD）患病率和病死率逐年增高，据《中国心血管病报告2017（概要）》[1]显示：我国心血管病防治工作已取得初步成效，但仍面临严峻挑战。总体上看，中国心血管患病率及死亡率仍处于上升阶段，推算心血管病现患人数2.9亿，其中冠心病有1100万。冠心病是指冠状动脉粥样硬化导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，属于中医的“胸痹”、“心痛”、“真心痛”等范畴，中医认为冠心病为“本虚标实”之证，五脏虚损是病之本，气滞、血瘀、痰浊是病之标[2]。

冠心Ⅱ号方是由著名中医临床家郭士魁先生所创制的，方由丹参、赤芍、川芎、红花和降香组成，具有活血化瘀的功效，临床多用于治疗冠心病心绞痛，现代药理学证明冠心Ⅱ号方可抗血小板积聚、降低血脂、抗动脉粥样硬化、增加冠脉血流量等[3]。但冠心Ⅱ号的药理学研究大多仍停留在整体药效研究的基础上和动物指标上，传统药理学方法尚不能全面、深入阐释冠心Ⅱ号方对冠心病的治疗作用机制。

随着网络药理学[4]、网络靶标[5]、系统药理学[6]等概念的提出与发展，这些新理念为中医药的研究带来了新契机。网络药理学是从系统的角度和分子的层面对中医药进行了系统的探索，将当前的“一靶一药”模式的研究模式更新为新的“网络靶多组分”模式[7]，系统药理学是从系统水平上研究药物与机体相互作用及其规律和作用机制的一门新兴学科，即从分子、网络、细胞、到组织、器官等不同水平上研究药物治疗疾病能变化机制，建立药物对于机体的作用从微观（分子、生化网络水平）到宏观（组织、器官、整体水平）的各水平间是相互关联的学问[8]，其系统性、整体性的特点与中医药整体观和辩证论治的原则相符合，为药物复杂作用的研究提供了新思路、新方法和新技术。LI[9]等为探讨参芪扶正注射液联合多烯紫杉醇治疗肺癌的机制，先通过网路药理学方法预测出参芪扶正注射液和多烯紫杉醇的作用靶点，然后通过体内和体外实验方法验证，实验结果与网络药理学预测的结果一致，说明网络药理学具有一定的准确性。因此本研究利用系统药理学方法，探讨冠心Ⅱ号方治疗冠心病的作用机制，以期为深入开展冠心Ⅱ号方治疗冠心病的基础实验研究提供参考和新思路。

1 数据库与软件

TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/），DrugBank数据库（https://www.drugbank.ca/），PharmMapper数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC 2896160/），CTD数据库(http://ctdbase.org/)，GeneGards数据库（https://www.genecards.org/），string数据库（https://string-db.org/），David 6.8在线分析软件（https://david.ncifcrf.gov/list.jsp），Cytoscape 3.6.1软件，IGEMDOCK 2.1，Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)。

2 方法

2.1 冠心Ⅱ号方有效活性化合物的筛选

中药系统药理学平台—TCMSP（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology Platform)是个融合了药物化学、药代动力学、网络靶点预测等网络信息的中药系统药理学数据库和分析平台，该数据库收录了近500个已经在中国药典注册过了的草药，囊括了超过31 000种化学成分。TCMSP构建的中药化学分子库较为全面，如在纳入皂苷类中药化合物时，还特意区分加入了皂苷去糖形式的化合物，使其中药化学库更加准确全面[10]。本研究利用TCMSP数据库，以口服生物利用度OB≥30%、类药性DL≥0.18为筛选条件，对冠心Ⅱ号方的五味药丹参、赤芍、红花、降香和川芎筛选出有效化合物，下载并保存为.mol2格式。

2.2 有效化合物的靶点预测

将2.1筛选出来的有效化合物，利用DrugBank数据库和PharmMapper服务器对这些有效化学成分进行作用靶点预测。基于PharmMapper服务器反向药效团匹配法，选择药效团模型，设定返回靶点数目为300，以.mol2格式上传到PharmMapper服务器，得到冠心Ⅱ号方化合物潜在的靶点信息。

2.3 化合物-靶点网络构建

将冠心Ⅱ号方五味药的化合物信息和化合物靶点信息导入Cytoscape软件中构建化合物-靶点网络图，在网络中，节点代表化合物、靶蛋白，边代表活性成分-靶点的相互作用，并利用Cytoscape软件中的Network Analyzer功能对化合物和靶点进行分析，Degree值越大，节点越大。

2.4 冠心病相关发病机制靶点的预测

利用GeneGards和CTD数据库筛选出与冠心病相关的靶点，以“coronary heart disease”为检索词进行检索，根据基因与疾病的相关度排序，各取前500个靶点，去掉重复的靶点，收集整合得到疾病靶点。

2.5 冠心Ⅱ号方对冠心病的潜在治疗靶点的收集

将2.2得到的化合物靶点数据与2.4得到的冠心病相关发病机制靶点数据通过VENNY在线分析软件进行比较，得到冠心Ⅱ号方对冠心病的潜在治疗靶点。

2.6 潜在治疗靶点的拓扑学分析和构建PPI网络

将潜在治疗靶点导入STRING数据库中，设定物种为“Homo sapiens”，获取蛋白相互作用，将结果保存为TSV格式文件，再将TSV格式文件导入Cytoscape软件里进行可视化分析，在软件中设置节点大小与颜色反映Degree大小变化，节点越大、颜色越深Degree越大，边的粗细反映Combined score大小变化，Combined score值越大边越粗，构建PPI网络。

2.7 相关通路信息和注释分析

将2.5得到的潜在治疗靶点导入DAVID数据库中，进行KEGG分析和GO分析，利用在线云平台OmicShare网站将KEGG通路绘制成气泡图，用Graphpad Prism 7.0软件绘制GO分析里的生物学过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。

2.8 活性成分与靶蛋白的分子对接

分子对接技术是基于配体与受体作用的锁匙原理研究小分子配体与受体生物大分子的相互作用，能有效地确定与靶受体活性部位空间和电性特征相匹配的小分子化合物[11]。从Uniprot数据库中找到潜在靶点的蛋白信息，保存为pdb格式，利用TCMSP数据库查找靶蛋白对应的活性成分，下载保存为.mol2格式，将靶蛋白数据信息和其对应的活性成分信息导入IGEMDICK软件进行分子对接，设置为默认参数：population size为200，Generation为70，number of solutions为2，Default Setting为Standart docking。

3 结果

3.1 冠心Ⅱ号方有效化合物的收集

通过TCMSP数据库搜集到160个符合OB≥30%、DL≥0.18条件的化合物，其中丹参65个，赤芍29个，红花22个，川芎7个，降香37个。去掉重复的化合物后共得到150个化合物。这150个化合物包括：芍药苷（paeoniflorgenone）、甜菜碱（Sativanone）、黄檀苷（Dalbergin）、黄芩素（baicalein）等，各个化合物的OB和DL值见表1。

表1 冠心Ⅱ号方有效化合物表*

3.2 有效化合物的靶点预测

PharmMapper在线分析软件是个通过反向药效团匹配方法搜寻潜在药物靶点,它能通过自动寻找与所查询的分子结构匹配最佳的药效团,再根据匹配程度给与打分[12]。根据PharmMapper反馈的靶点，按匹配度从高到低，每个化合物取前十个靶点，PharmMapper没有反馈回来的靶点从DrugBank数据库里搜索补充。将收集到的所有靶点逐个输入UniProt数据库,利用UniProtKB再次确认靶点信息，限定物种为“Homo sapiens”，剔除掉非人源靶点和重复靶点，并校正为其官方名称（official symbol），收集整合最后得到176个靶点。将化合物和靶点信息一同导入Cytoscape软件中构建“化合物-靶点网络图”，见图1。由网络图可看出每一种化合物可有多个对应靶点，每个靶点并不只对应一种化合物，提示冠心Ⅱ号方具有多成分、多靶点的特点。

图1 冠心Ⅱ号方化合物-靶点网络图

3.3 冠心病相关发病机制靶点的预测与潜在治疗靶点的收集

利用GeneGards和CTD数据库，以“coronary heart disease”为检索词进行检索，根据基因与疾病的相关度排序，各取前500个靶点，剔除掉重复的靶点后得到645个靶点蛋白，将这645个靶点和化合物的176个靶点一同导入VENNY在线分析软件，得到交集靶点22个，见图2。

图2 冠心Ⅱ号方化学成分靶点与冠心病相关疾病靶点Venny图

3.4 潜在靶点的拓扑学分析

为了更直观地观察潜在治疗靶点之间的关系，将22个潜在靶点导入string软件中构建PPI网络，再将得到的蛋白互作网络导入Cytoscape软件进行网络拓扑属性分析。见表2、图3。如图3所示，丹参-赤芍药对对急性心肌梗死作用的潜在靶蛋白PPI网络有22个节点，经计算后可知，平均连通度约为9.36，平均最短路径长度在1.2-1.7之间，平均介数约为0.03，平均聚类系数约为0.7。度值大的节点被认为是中心节点[13]，其中度值（连通度）超过平均数的节点有10个，说明这10个节点作为蛋白互作网络中的核心节点，可能是冠心Ⅱ号方治疗冠心病的关键靶标。

3.5 相关通路信息和注释分析

将22个交集靶点导入David数据库进行GO分析和KEGG分析，经过Bonferroni校正P值<0.05,得到75个生物学过程，包括血压调节、对活性氧的反应、一氧化氮生物合成过程的正调控等；13个细胞组成，包括线粒体、细胞外间隙、细胞器膜等；15个分子功能，包括超氧化物歧化酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、生长因子活性等；以及8条信号通路，包括：肿瘤信号通路、FOXO信号转导通路、ErbB信号通路、和AMPK信号通路等。冠心Ⅱ号方的作用靶点涉及多种生物过程及多条通路，说明冠心Ⅱ号方可以通过调节这些生物过程和通路来发挥治疗作用。

表2 冠心Ⅱ号方潜在靶点的拓扑属性表

图3 潜在靶点的PPI网络

3.6 分子对接验证

IGEMDOCK是款开源性的分子对接软件，一般用于活性筛选和快速对接，IGEMDOCK软件的分子对接结果是以能量的高低对化合物结合程度来判断的，能量越低，化合物分子与受体结合的作用可能性越大。临床研究[14-15]表明丹参酮ⅡA磺酸钠注射液治疗冠心病疗效显著，不良反应少，丹参酮ⅡA磺酸钠注射液的主要成分是丹参酮ⅡA，本研究以阳性对照药丹参酮ⅡA打分函数值作为参考阈值，进行比对分析。分子对接结果见表3，由表可知冠心Ⅱ号方与22个冠心Ⅱ号方对冠心病的作用靶点结合性良好，且基本上优于丹参酮ⅡA，在这22个靶点中，其中结合性最强的是GSR与SalvilenoneⅠ，分子结合模式见图6。

图4 冠心Ⅱ号方对冠心病作用靶点的GO分析

4 讨论

冠心病是常见的心血管疾病，目前被广泛应用于临床的西医治疗手段有经皮冠状动脉介入治疗（PCI）、冠状动脉支架植入术（ICSI）等，但这些方法存在血管内皮损伤及血栓形成、血管炎症等问题[16]，中医药在防治冠心病方面具有独特的优势，能够从多靶点、多途径、多环节干预冠心病的发生、发展，它是从整体治疗，具有不良反应小、价格低廉、标本兼治等优势[17]。冠心Ⅱ号方是治疗冠心病的一个经验方，临床研究和实验研究均证实其有显著的治疗效果。

本研究通过TCMSP数据库筛选出有效化合物150个，这些化合物包括芍药苷（paeoniflorgenone）、黄芩素（baicalein）、丹参酮ⅡA（tanshinone iia）、槲皮素(quercetin)等。实验[18]表明芍药苷预处理能降低大鼠微血管内皮细胞的凋亡,对微血管内皮细胞发挥保护作用；黄芩素可抑制血管平滑肌细胞的增殖并促进其凋亡[19]；槲皮素具有抗氧化性，能清除自由基、减少毛细血管脆性、扩张冠状动脉。这些化合物都与血管上皮细胞、心肌细胞或者脂质代谢有关，由此推测，冠心Ⅱ号方通过这些化合物的协同作用对冠心病发挥疗效。

图5 冠心Ⅱ号方对冠心病作用的KEGG气泡图

预测出冠心Ⅱ号方治疗冠心病的22个潜在靶点，经过分析发现这些靶点共同参与多种生物过程。如BMP2、GSR、HGD、PTGS1、PTGS2、SDHA、SOD2和SOD1共同参与氧化还原反应，PTGS1、PTGS2、SOD1、SOD2共同调控血压调节，而MTOR、PTGS2和SOD2则参与一氧化氮生物合成过程的正调控。李慧等[20]研究证明PTGS2可以促进血管平滑细胞的增殖和迁移，同时促进其表型的转化；超氧化物歧化酶SOD1、SOD2是生物体内重要的抗氧化酶，可清除人体内过多的有害的氧自由，有调节血脂、预防动脉粥样硬化，降低脂质过氧化物的含量等作用；IL10是一种重要的抗炎和免疫调节因子，对机体的免疫功能和炎症过程有着重要的调节作用；这些生物学过程均与冠心病的发生机制有关，因此推测冠心Ⅱ号方对治疗冠心病的作用机制可能与其诱导这些基因表达有关。

在KEGG分析中，得到8条通路，与冠心病相关的通路有4条，分别是FOXO信号转导通路、ErbB信号通路、HIF-1信号通路和AMPK信号通路。FOXOs转录因子作用复杂多样，涉及许多重要的细胞过程，包括氧化应激、细胞代谢、参与细胞凋亡和自噬等[21]，心肌FOXOs可通过诱导抗氧化剂和细胞存活途径在氧化应激条件下促进心肌细胞存活，对缺血心肌发挥保护效应[22]，且Foxo蛋白能通过抑制钙调磷酸酶/活化T淋巴细胞核因子途径抑制心肌细胞的增大，在心肌肥大的发生中发挥负性调节作用[23]。NRG1是一种神经调节蛋白,它能通过激活ErbBs蛋白的受体酪氨酸激酶进行一系列的信号转导，NRG1及其ErbBs受体信号系统在正常心脏的形成和发育过程中具有决定性的作用[24]。HIF-1是调节缺氧的转录因子，在细胞稳态、生理学和疾病中起关键作用[25]，Wei等[26]研究表明HIF-1基因敲除加重压力超负荷诱导的心肌纤维化、心肌细胞肥大、心肌毛细血管密度降低和心肌细胞凋亡，促进心力衰竭发生。AMPK是生物体内的关键代谢调节酶，能调节机体内糖、蛋白质、脂肪的代谢，维持细胞能量稳态，是目前治疗血管疾病的一个重要靶点。在动物实验中，AMPK的激活能够降低肥胖的风险和糖尿病相关的比如胰岛素抵抗，代谢综合征和动脉粥样硬化性心血管疾病发生率[27]，许多报道已证实AMPK在平滑肌中调节血管张力的重要性，以及AMPK功能异常可能会导致高血压、动脉粥样硬化和内皮功能障碍等[28]。综上，推测冠心Ⅱ号方通过调控这些通路对冠心病产生治疗作用。

表3 潜在治疗靶点与相对应的化合物分子对接结果表

图6 GSR与salvilenoneⅠ分子对接结果图

分子对接结果按照结合能由大到小的顺序排列见表3，显示这22个靶蛋白与化合物均能结合，其中GSR（谷胱甘肽还原酶）与salvilenoneⅠ（沙维烯酮Ⅰ）的结合性是最好的，谷胱甘肽还原酶是一种帮助保护细胞免受氧化应激损坏的酶，机体内的自由基和过氧化氢等会产生氧化产物，这些产物会损害细胞成分，导致细胞变异或加速衰老，而谷胱甘肽还原酶参与氧化还原过程，能将谷胱甘肽返回原来的状态，使之继续行使细胞抗氧化功能。杨芳[29]等发现动脉粥样硬化时机体的抗氧化作用减弱，存在氧化应激，说明改善机体的氧化还原状态有可能减慢或阻止动脉粥样硬化的发生与发展。表明冠心Ⅱ号方有效活性成分可能通过与GSR结合对冠心病发挥治疗作用。其他化合物与靶标也有很好的结合力，分子对接的结果也进一步为冠心Ⅱ号方治疗冠心病提供了新的思路。

综上所诉，本研究利用系统药理学方法，从整体水平观察“药物-靶点-疾病”复杂网络关系，挖掘冠心Ⅱ号方的潜在治疗靶标、生物学信息和分子机制，探究冠心Ⅱ号方对冠心病的作用机制。发现冠心Ⅱ号方主要是通过有效化合物的协同作用，参与到血压调节、脂质代谢、一氧化氮生物合成过程的正调控、心肌细胞的代谢等生物学过程，进一步对冠心病起到干预作用，与现代药理研究相符，为进一步从冠心Ⅱ号中提取有效活性成分治疗冠心病提供了参考依据和新的思路。本研究是通过现有的文本挖掘和大数据来进行预测，研究可能存在一些局限性，如网络信息技术尚不全面、数据库不够完整、评判标准不一的问题，因此，此研究后期有必要通过基础实验加以验证。