重组酶聚合酶扩增技术在番茄黄化曲叶病毒检测中的应用

周 莹 杨丽梅 刘 梅 黄金宝

（1北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097；2北京市大兴区榆垡镇农业技术推广站，北京 102602）

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）是世界范围内造成番茄严重减产的重要病害，由双生病毒科（Geminiviridae）病毒侵染所致。番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是番茄上发生很普遍的双生病毒之一，隶属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）（Varsani et al.，2014），主要通过烟粉虱（Bemisia tabaci）传播，可以侵染茄科、豆科等多种植物，基因组只含单组分的DNA-A，大小约2.8 kb，共编码6个开放阅读框（ORF）（Sondra & Lazarowitz，1992；Moriones &Navas-Castillo，2000）。TYLCV最早发现于中东以及地中海地区，1964年以色列就有其发生危害的报道（Cohen & Harpaz，1964）。随着全球气候变暖和耕作制度的改变以及国际贸易的增加，TYLCV在全球范围传播（Moffat，1999）。我国于2006年在上海首次发现（Wu et al.，2006），随后从南向北扩散流行（赵统敏 等，2007；余文贵 等，2009；周莹 等，2010；金凤媚 等，2011；熊艳 等，2011），2009年北京地区首次报道了TYLCD的发生（李明远，2009），后续的研究确认了是由TYLCV引起（宋晰 等，2013；周莹 等，2016）。该病毒引起的危害与侵染番茄植株的早晚直接相关，植株越早感染造成的损失越大，因此做好病毒检测是病害防控工作中的一项重要环节。

TYLCV比较常用的检测方法是基于血清学的酶联免疫方法和基于PCR技术的分子检测，血清学方法检测植物病毒病具有直观、方便等特点，但在灵敏度方面依赖于抗血清的品质，在鉴别近缘病毒时有困难（季英华 等，2013；张伟 等，2013）。PCR分子检测方法比血清学方法的灵敏度高，经过预热-变性-退火-延伸等热循环过程来实现核酸的扩增，是目前植物病毒常规的检测方法之一。李常保等（2012）基于病毒基因组特异区段设计特异引物，达到TYLCV快速高效的分子检测。等温核酸体外扩增是20世纪90年代出现的一种新型技术，这种技术是在恒定温度下，通过一些特殊的蛋白（酶）双链解螺旋，并促使特异性DNA片段扩增，以达到核酸体外扩增的效果。等温核酸体外扩增不需要高温变性、退火和延伸等环节，核酸扩增变得更加便捷，也摆脱了对核酸扩增仪的依赖。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplifcafion，RPA）技术是近几年发展起来最接近等温的扩增技术。在25～42 ℃范围内的等温条件下，重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白SSB的作用下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。RPA产物与普通PCR一样，为单一的扩增产物。目前RPA技术在医学病原物快速诊断中得到了一些应用（樊晓旭 等，2016；吴耀东 等，2016），农业领域中主要用于转基因作物的检测（徐潮 等，2014；邓婷婷 等，2015；刘静 等，2018），植物病原物的检测方面也有若干报道（魏梅生 等，2016；张娜 等，2016）。国内尚未有RPA技术在番茄病毒检测方面的报道，本文依据TYLCV基因组的保守序列，建立不依赖于复杂变温仪器、操作简单的TYLCV-RPA检测技术，为蔬菜生产中TYLCV的田间调查和无毒苗的生产提供一种可选的检测方法。

1 材料与方法

1.1 植物样品

试验于2017年3月至2018年3月在北京市农林科学院植物保护环境保护研究所植物病害防控研究室实验室完成。

感染番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）的样品和待检测番茄样品均采自北京海淀区和大兴区，健康样品为温室网室中种植的番茄，所有样品均经PCR检测和序列测定确认后于-80 ℃保存。感染烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的烟草材料由本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器

植物DNA提取试剂盒、植物RNA提取试剂盒为TaKaRa公司产品，2×TaqDNA Master mix购于北京博迈德基因技术有限公司，TwistAmp Basic试剂盒（TwistDx）购于畅宇云商（北京）科技有限公司；主要仪器有Nanodrop核酸浓度测定仪、凝胶成像仪、电泳槽、金属加热浴等。

1.3 植物样品总DNA和RNA的提取

样品DNA和RNA分别使用植物核酸提取试剂盒提取，按照试剂盒说明书操作。

1.4 引物设计

参照番茄黄化曲叶病毒DNA-A基因序列（GenBank：KM506961.1），结合RPA引物设计的要求，设计1对RPA引物（表1）。引物由生工生物工程有限公司合成。

1.5 RPA方法的建立

1.5.1 RPA反应体系 取1 μL DNA作为模板，依次加入ddH2O 13 μL，10 pmol·L-1的正反向引物各2 μL，干粉溶解缓冲液（rehydration buffer）29.5 μL，最后加入 280 mmol·L-1醋酸镁 2.5 μL启动反应，总体积为50 μL，混匀后37 ℃孵育40 min。50 μL RPA产物与同体积的（Tri饱和酚∶氯仿=1∶1）混合，12 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，20 min后染色拍照。

表1 用于检测TYLCV的RPA引物

1.5.2 特异性测试 以ToCV阳性的番茄叶片、TMV和CMV阳性的烟草叶片RNA为模板进行反转 录：dNTPs（2.5 mmol·L-1）3 μL，5×MMLV buffer 2 μL，MMLV（200 U·μL-1）1 μL，Rnaseinhibitor（40 U·μL-1）1 μL，随机六聚引物和Oligo（dT）18 引物各0.5 μL，植物总RNA 1 μL，用灭菌ddH2O补足到20 μL，混匀后42 ℃温育1 h获得cDNA。将获得的cDNA与TYLCV阳性样品DNA各取1 μL进行RPA反应，同时设置健康样品阴性对照。

1.5.3 灵敏度测试 将番茄黄化曲叶病毒阳性样品DNA进行浓度测定，做10倍梯度稀释，用引物对F3/R3分别进行RPA和普通PCR反应，比较两种方法的灵敏度。普通PCR反应体系：2×TaqDNA Master mix 12.5 μL、F3和R3引物各1 μL、不同浓度的DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。

1.5.4 样品检测 为了进一步确定RPA-TYLCV检测体系的可靠性，收集9个番茄样品，其中7个样品呈现叶片黄化皱缩的症状，有2个样品未表现上述症状，以待测样品DNA为模板，进行RPA扩增，同时以TYLCV阳性样品和健康番茄样品DNA作为阳性、阴性对照。

2 结果与分析

2.1 RPA方法的特异性分析

特异性分析结果见图1，除了TYLCV阳性样品扩增出343 bp的目的条带外，ToCV、CMV、TMV阳性样品和阴性对照均未出现条带，表明建立的TYLCV RPA检测方法具有很好的特异性。

2.2 RPA方法的灵敏度分析

经Nanodrop核酸浓度测定仪测定，番茄样品DNA浓度为50 ng·μL-1，10倍梯度稀释后进行RPA和普通PCR反应，结果表明（图2），RPA反应的检测灵敏度达到50 pg·μL-1，是普通PCR反应的10倍。

2.3 样品检测

图1 RPA方法检测TYLCV的特异性

图2 RPA和PCR法检测TYLCV的灵敏度比较

图3 采用RPA方法进行TYLCV检测

从图3可以看出，9个待测番茄样品中有7个与阳性对照都扩增出目的条带，2个样品和阴性对照未扩增出任何条带，与7个样品呈现叶片黄化皱缩的症状表现相符，说明建立的RPA方法能够用于番茄样品的TYLCV检测。

3 结论与讨论

本试验以番茄病毒病的病原番茄黄化曲叶病毒为靶标，建立了RPA检测方法。该方法操作简单，反应时间短，灵敏度高，只需1对引物，在37 ℃下反应40 min即可达到高于普通PCR 10倍的扩增结果，目的条带为343 bp大小的特异性条带；仪器要求简单，仅需要1个恒温装置，水浴、金属浴以及恒温培养箱均可以满足扩增要求；方法特异性好，与番茄其他常见病毒无交叉反应。该方法适合基层单位和现场检测使用，为TYLCV的病害调查、田间诊断以及无毒苗木的生产提供了简单高效的技术方法。

番茄黄化曲叶病毒是近几年严重影响番茄生产的重要病毒病原，其引起的危害与感染时期相关，越早感染对生产造成的损失越大，因此做好检测工作意义重大。核酸等温体外扩增是近几年发展起来的核酸体外扩增技术，与传统的聚合酶链式反应PCR相比，不依赖于温度循环的特殊仪器，并且具有快速、灵敏等优点，逐渐显示出其广泛应用的潜力。等温核酸体外扩增技术有多种形式，包括转录介导扩增（transcription mediated amplification，TMA）、链置换扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖解旋酶扩增（helicase-dependent amplification，HAD）、滚环扩增（rolling-circle amplification，RCA）和环介导扩增（loop-mediated amplification，LAMP）等（汪琳 等，2011）。早期的等温扩增技术在反应条件、试剂仪器要求以及操作简便性等方面存在一定的弊端。如TMA主要应用于RNA扩增，若检测DNA则需要在循环相前对样品进行高温变性，使其变成单链DNA。SDA、HDA、RCA及LAMP等均需在65 ℃下进行退火，LAMP技术需要4条引物，引物设计比较复杂，除此之外，还需要较长的反应时间和较高的反应温度。RCA和LAMP技术在植物病原物检测中有部分报道（余玲玲 等，2008；秦文韬 等，2013）。RPA是目前最接近常温的核酸扩增技术，常温下即可使核酸快速扩增；而且在检测时间上具有优势，整个扩增反应最短15 min即可完成，快于其他等温扩增技术和普通PCR；此外，RPA引物设计虽没有像传统PCR引物那样成熟，但经过引物筛选和条件优化可以建立起一套检测技术。上述优势使得RPA技术在基层快速诊断上具有较大的发展空间。RPA技术作为一种新兴检测技术，还有需要完善的地方，如RPA扩增体系中存在大量蛋白酶，所以扩增产物必须除去蛋白之后才能进行电泳或后续试验。本试验将RPA技术应用到番茄病毒检测中，扩展了其使用范围，后续将对检测样品的前处理方法进行简化，进一步缩短检测时间和提高检测效率。