湘西永顺产山苍子精油成分分析与抑菌活性研究

彭湘莲 付红军 刘微微

(中南林业科技大学食品科学与工程学院1，长沙 410004)(稻谷及副产物深加工国家工程实验室2，长沙 410004)

山苍子(Litseacubeba) 别名山鸡椒，属于樟科木姜子属植物，在我国广泛种植，主要分布于湖南、湖北、江西、浙江、福建、云南等地[1]。山苍子油是从山苍子果实或其他组织中提取出来黄色油状液体，由于产地地理条件的差异导致其成分会有所不同。山苍子油中的活性成分主要有柠檬醛、D-柠檬烯、马鞭烯、芳樟醇、香叶醇、香茅醇等成分，其中抑菌效果较好的为柠檬醛[2]。

研究表明，山苍子油具有一定的抑菌活性，其对大部分的真菌和细菌具有一定的抑制或灭杀作用[3-4]。余伯良等[5]采用平板法研究山苍子油对花生酱的防霉保鲜效果，结果表明当培养基 pH 5.5时，山苍子油对多数霉菌的最低抑菌浓度为1.77 mg/mL。李文茹等[6]使用了平板菌落计数法进行山苍子精油的抑菌实验，山苍子精油对黑曲霉和绳状青霉的最低抑菌浓度分别为0.125%和0.25%，山苍子精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.125%。吴均等[7]采用抑菌圈实验对山苍子油的抑菌活性进行测定。5%的山苍子油在含有金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的培养基中有抑菌圈生成，而在含有大肠杆菌的培养基中未出现抑菌圈。

目前我国对于山苍子油的用途主要为食用香料，由于其无毒且有显著的抑菌效果，使得在食品防腐保鲜领域备受青睐。本实验选用湘西永顺产山苍子果实，采用水蒸气蒸馏法[8]提取山苍子精油，利用气相色谱-质谱法分析山苍子精油的化学成分，选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉4种菌种为代表菌种，通过测定平板菌落计数、最低抑菌浓度、热处理影响以及pH值影响来测定山苍子精油的抑菌活性，为山苍子精油的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

新鲜山苍子果实(采自湖南省湘西永顺土家族苗族自治州)；结晶紫中性红胆盐琼脂、Baird-Parker琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基；其他试剂均为分析纯。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉(中南林业科技大学食品科学与工程学院微生物实验室提供)。

1.1.2 仪器与设备

Clarcus 600 GC-MS联用仪；WK-10B高能性中药粉碎机；MJ-54A型高压蒸汽灭菌锅；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台。

1.2 实验方法

1.2.1 水蒸气蒸馏法提取山苍子精油

将山苍子果实阴干后粉碎后过20目筛，密封保存于冰箱备用。称取50 g粉末样品置于1 000 mL圆底烧瓶中，并加500 mL蒸馏水，用电热套进行水蒸气蒸馏提取直至无挥发油产生，用石油醚收集油层，待石油醚挥发后称量。按《中国药典》2010 版一部附录 XD 挥发油测定法测定山苍子干果中山苍子精油含量，平行测定 3 次，取平均值，并将山苍子精油置于冰箱保存，用于后续GC-MS分析和抑菌活性测定。

1.2.2 山苍子精油的成分分析(GC-MS)

采用美国Perkin Elmer公司Clarcus 600气质联用分析仪。GC条件：色谱柱为Elite-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序: 80 ℃保持3 min，5 ℃/min升温至100 ℃，保持1 min， 10 ℃/min升温至130 ℃，保持3 min，20 ℃/min升温至230 ℃，保持6 min； 载气为高纯氦气；进样口温度250 ℃；进样量0.5 μL；分流比50∶1。MS条件：电子轰击离子源进样方式；电离电压70 eV；离子源温度240 ℃；传输线温度280 ℃；质量扫描范围m/z35～500。山苍子精油的GC-MS定量分析采用峰面积归一化法，化合物定性采用NIST标准谱库[9]。

1.2.3 菌种的活化及菌悬液的制备

配制适量培养基，高压蒸汽灭菌之后倒于无菌培养皿之中，待冷却凝固后，将大肠杆菌接种在结晶紫中性红胆盐琼脂平板上，将金黄色葡萄球菌接种在Baird-Parker琼脂平板上，34 ℃培养 24 h；将白曲霉、青霉2种霉菌转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基斜面中活化，28 ℃培养 48 h。挑取少量菌落于无菌生理盐水中，细菌采用平板计数法，霉菌使用显微镜直接记数法测菌体个数，将菌悬液浓度调至 106～107CFU/mL，备用。

1.2.4 平板菌落计数法

1 mL山苍子精油加10 mL无菌培养基混匀冷却，1 mL丙三醇加10 mL无菌培养基作为空白对照；冷却后取200 μL菌悬液涂布于平板培养基上，按1.2.3的条件进行培养，每个菌种做3组平行，观察菌落生长情况。

1.2.5 最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法，配制一系列梯度浓度的山苍子精油丙三醇溶液，与熔融的培养基混匀，使得培养基中山苍子精油的浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.23、0.11 μL/mL；待培养基凝固后，用移液枪吸取 200 μL菌悬液，均匀涂布于固体培养基表面[7]。以不长菌时的山苍子精油的体积浓度来确定山苍子精油抑菌的最低体积浓度为山苍子精油的MIC值，以丙三醇-无菌水作对照。

1.2.6 热处理对山苍子精油抑菌活性的影响

将山苍子精油分别于40、60、80、100 ℃下热处理10 min，取出后立刻置于冰浴中冷却待用；10 mL含1/2 MIC山苍子精油浓度的无菌培养基冷却待用；待培养基冷却后，取200 μL菌悬液均匀涂布在平板上，以等量无菌水涂布作为空白对照，按1.2.3的条件进行培养，每个菌种做3组平行取均值。

1.2.7 pH值对山苍子精油抑菌活性的影响

利用磷酸缓冲液来调制不同pH值的培养基，pH值梯度浓度分别为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5；山苍子精油与无菌培养基混匀使得培养基中山苍子精油的浓度为1/2 MIC，冷却后取200 μL菌悬液均匀涂布在平板上，以等量无菌水涂布作为空白对照，按1.2.3的条件进行培养，每个菌种做3组平行取均值。

2 结果与分析

2.1 山苍子精油的含量

按1.2.1进行水蒸气蒸馏测得山苍子干果粉末中山苍子精油平均质量分数为3.28%。

2.2 山苍子精油的主要成分

水蒸气蒸馏法提取得到的山苍子精油利用GC-MS法进行成分分析，其TIC见图1，主要化学成分鉴定出23种物质详见表1，其中柠檬醛的质量分数为74.07%(橙花醛38.57%；香叶醛35.50%)，高于赣南产山苍子油的68.43%[10]。

图1 水蒸气蒸馏法提取的山苍子精油的TIC

表1 湘西永顺产山苍子精油的化学成分

序号化合物名称分子式质量分数/%1α-蒎烯C10H161.152莰烯C10H160.473桧烯C10H160.414β-蒎烯C10H160.8056-甲基-5庚烯-2酮C8H14O1.146β-月桂烯C10H161.517柠檬烯C10H166.528桉树脑C10H18O1.419芳樟醇C10H18O1.76105-甲基-2-异丙烯基-4-己烯醛C10H16O0.2511香茅醛C10H18O2.2012龙脑C10H18O0.0813α-松油醇C10H18O0.63141,3,4-三甲基-3-环己烯基1-甲醛C10H16O1.2015橙花醇C10H18O0.7016橙花醛C10H16O38.5717香叶醇C10H18O1.0118香叶醛C10H16O35.50193,7-二甲基-2,3-环氧基-6-辛烯醇C10H18O20.1820β-榄香烯C15H240.32211-石竹烯C15H241.1522α-丁子香烯C15H240.1823氧化石竹烯C15H24O0.32其他2.54

2.3 平板计数的结果与分析

山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉和青霉的抑菌活性如表2所示。结果表明，添加了丙三醇的平板培养基上，4种菌都长出了菌落，且生长情况良好；而添加了山苍子精油的平板培养基上均未有菌落生长，可见山苍子精油对4种菌都表现出了有效的抑制作用。

表2 山苍子精油的抗菌活性

注：“+”表示平板上有菌落生长，“—”表示平板上未长出菌落。

2.4 山苍子精油最低抑菌浓度的结果与分析

山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉和青霉的最低抑菌浓度(MIC)如表3所示。

山苍子精油对霉菌抑菌效果优于细菌。山苍子精油对青霉、白曲霉的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.47、0.94 μL/mL，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC) 分别为1.88、0.94 μL/mL，对细菌的抑菌结果与吴均等[7]的实验结果有些许差异，可能由于山苍子精油中柠檬醛含量差异所致。

表3 山苍子精油对霉菌和细菌最低抑菌浓度

注：“+”表示平板上有菌落生长，“—”表示平板上未长出菌落。

2.5 热处理对山苍子精油抑菌活性的影响

不同温度热处理后的山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉4种菌的抑菌活性如表4所示。

表4 不同温度处理后山苍子精油对实验菌种菌落数的影响/个

从表4可以看出，当热处理温度在40～60 ℃区间时，温度对山苍子精油抗菌活性影响不大，而热处理温度在60～100 ℃区间时，温度升高使山苍子精油中有效抑菌活性物质挥发或发生裂解，导致山苍子精油抑菌活性有所下降。

2.6 pH值对山苍子精油抑菌活性的影响

不同pH值条件下山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉4种菌的抑菌活性如表5所示。

表5 不同pH值条件下山苍子精油对对实验菌种菌落数的影响/个

由表5可知，在pH值为3.5～7.5的条件下，山苍子精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌活性的影响较大，pH值越小山苍子精油的抑菌效果越好；但对白曲霉和青霉而言，不同pH值对山苍子精油的抑菌活性影响不大，可能是霉菌相对于细菌来说更易在酸性环境下生存。由此可知当pH值在3.5～7.5的范围内， pH值越小山苍子精油抑菌效果越好，而pH值对山苍子精油抑霉菌活性影响不大。

3 结论

本实验采用水蒸气蒸馏法对湘西永顺产的新鲜山苍子果实进行提取，其山苍子精油质量分数为3.28%。利用气相色谱-质谱法分析鉴定出湘西永顺产山苍子精油的主要化学成分有23种，其中柠檬醛质量分数为74.07%(橙花醛：38.57%；香叶醛：35.50%)。山苍子精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白曲霉、青霉4种菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为1.88、0.94、0.94、0.47 μL/mL。山苍子精油能抑制细菌和霉菌的生长。当热处理温度在40～100 ℃区间时，温度导致山苍子精油的抑菌活性有所下降；当pH值在3.5～7.5内，pH值越小山苍子精油的抑菌效果越好，而pH值对山苍子精油抑霉菌活性的影响不大，具体抑菌机理有待进一步探讨。