德宏州番茄病毒病发生情况调查及其毒源种类分析

张培花 王根权 李翱

摘要    对德宏州番茄主产区病毒病发生情况进行调查并对采自德宏州4个县市的85份番茄样品进行了DAS-ELISA、dot-ELISA检测以及PCR检测。结果表明，番茄病毒病在德宏州主要番茄主产区均有发生，发病症状主要表现为黄化曲叶、皱缩、矮化、花叶、脉突、蕨叶、叶片发紫，单独或混合发生，一般发病率为5%～30%，甚者达80%以上，个别田块达100%。在检测的85份样品中，有58份番茄样品感染了所检测病毒，病毒检出率为68.24%，病毒种类有12种，其中以双生病毒科的泰国番茄黄化曲叶病毒为主，占27.06%，其他依次是番茄斑萎病毒属番茄环纹斑点病毒（22.41%）、烟草曲茎病毒（7.06%）、中国番茄黄化曲叶病毒（5.17%）、越南番茄黄化曲叶病毒（3.45%）。

关键词    番茄病毒病;发病情况;毒源种类;云南德宏

中图分类号    S436.412.1+1        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）23-0120-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

番茄经济价值高，在世界各地得到广泛栽培。受栽培制度、品种等因素影响，番茄病虫害防治存在一定的难度，尤其是病毒病。病毒病在我国南北种植区发生普遍，危害严重[1]。番茄作为冬早蔬菜种植的主要品种，已成为德宏州冬农开发的新亮点，但因常年连作、栽培管理和防治措施不到位，导致冬、春季番茄病毒病日趋严重，严重影响番茄产量和品质。目前，国际上已报道危害番茄的病毒超过30种[2]，我国先后检测出13种病毒[3-7]，对德宏州番茄病毒病的毒源种类还未进行过系统的研究。本文利用DAS-ELISA和dot-ELISA技术对采自德宏州4个县市的番茄病毒病样品进行了8种茄果类蔬菜常见病毒的血清学检测，利用PCR技术对番茄双生病毒进行了检测，以期为番茄病毒病的防治提供参考。

1    材料与方法

1.1    试验材料

试验作物为番茄，调查对象为番茄病毒病。

供试试剂有INSV、IYSV和GRSV/TCSV复合抗血清，购自美国Agdia公司;TZSV、GYSV、WSMoV、HCRV多克隆抗体，由德宏州植保植检站实验室制备;TSWV单克隆抗体，由浙江大学周雪平教授提供。

1.2    试验方法

1.2.1    样品采集。2015年11月至2017年2月在德宏州芒市、瑞丽市、陇川县、盈江县4个县市番茄种植田块调查番茄病毒病发生情况，采集典型病毒病症状的番茄叶片、嫩梢或果实样品，对样品进行编号和症状记录，并分别装入已标记的自封袋中，放入-20 ℃的冰箱中冷冻保存，备用。

1.2.2    病毒病原检测。分以下2种进行。

（1）番茄斑萎病毒属病毒检测。采集感病的典型番茄斑萎病毒病害样品分别用tospoviruses抗血清进行DAS-ELISA和dot-ELISA检测。用于dot-ELISA的 TZSV、GYSV、WSMoV、HCRV多克隆抗体按照1/3 000进行稀释，TSWV单克隆抗体按照1/3 000进行稀释。

（2）菜豆金色花葉病毒属病毒检测。典型双生病毒病害症状病株叶片总DNA采用CTAB法提取[8]。利用菜豆金色花叶病毒属病毒简并引物PA/PB进行PCR检测，菜豆金色花叶病毒属病毒基因共同区及外壳蛋白保守区约500 bp的基因片段[9]是该引物扩增的目的条带。与此同时，利用beta卫星通用引物β01/β02和alpha卫星通用引物UNA101/UNA102对双生病毒典型病株进行PCR检测，这2对引物的目的条带分别为其卫星全长[10-11]。PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）2.5 μL、2.5 μmol/L dNTPs 2 μL、20 μmol/L上游、下游引物各0.5 μL、5 U/μL Taq Plus DNA聚合酶0.5 μL、植物总DNA 125 ng，加双蒸水定容至25 μL。扩增条件：94 ℃ 预变性2 min;94 ℃变性45 s，50℃退火45 s，72 ℃延伸50/90 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。紫外灯下割取目的片段，利用Axygen DNA凝胶回收试剂盒分离纯化，回收产物连接到pGEM-T Easy（Promega，Madison，WI）载体上，通过热击法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆，送上海立菲生物技术有限公司进行测序。

2    结果与分析

2.1    番茄病毒病发生情况

根据2015—2017年田间调查，在德宏州芒市风平镇、瑞丽市勐卯镇、陇川县景罕镇、盈江县旧城镇等番茄主产区均发生了番茄病毒病，症见黄化曲叶、皱缩、矮化、蕨叶、花叶、脉突、叶片发紫，单独或混合发生，一般发病率为5%～30%，甚者达80%以上，个别田块达100%。芒市风平镇、盈江县旧城镇露地番茄黄化曲叶症状比较明显，以点、片发生为主。瑞丽市勐卯镇、陇川县景罕镇大多为大棚栽培，栽培管理较好，番茄病毒病发病较轻，发病率大部分在5%以下。

2.2    番茄样品的病毒种类分析

2015年11月至2017年2月在德宏州芒市、瑞丽市、陇川县、盈江县4个县市采集了85份番茄样品进行病毒病检测，其中有58份番茄样品带毒，病毒检出率为68.24%，病毒种类有12种，其中以双生病毒科的泰国番茄黄化曲叶病毒为主，占27.06%，其次是番茄斑萎病毒属的番茄环纹斑点病毒（TZSV），占22.41%，烟草曲茎病毒占7.06%，中国番茄黄化曲叶病毒占5.17%，越南番茄黄化曲叶病毒占3.45%。芒市检测到5种病毒，泰国番茄黄化曲叶病毒是芒市番茄上的优势毒源，检出率为46.88%，其次是TZSV、泰国番茄黄化曲叶病毒、番茄黄化曲叶病毒，检出率均为9.38%，再次是PaMMV（辣椒轻型斑驳病毒），检出率为3.12%。瑞丽市检测到3种病毒，主要以泰国番茄黄化曲叶病毒为主，检出率为40%，其次是泰国番茄黄化曲叶病毒Beta卫星和木耳坦棉花黄化曲叶病毒Beta卫星，检出率为10%。陇川县检共测到4种病毒，TZSV是陇川县番茄上的优势毒源，检出率为40.91%，其次是烟草曲茎病毒，检出率为22.73%，再次是PaMMV和朱顶红褪绿环斑病毒，检出率均为4.55%。盈江县检测到 6种病毒，主要以泰国番茄黄化曲叶病毒为主，检出率为19.05%，其次是越南番茄黄化曲叶病毒和胜红蓟黄脉病毒Beta卫星，检出率均为9.52%，再次是TZSV、WSMoV（西瓜银色斑驳病毒）和烟草曲茎病毒，检出率均为4.76%。

3    结论与讨论

调查发现，番茄病毒病在德宏州芒市风平镇、陇川县景罕镇、盈江县旧城镇、瑞丽市勐卯镇等番茄主产区均有发生。芒市风平镇、盈江县旧城镇露地番茄黄化曲叶症状比较明显，以点、片发生为主。瑞丽市勐卯镇、陇川县景罕镇大多数为大棚栽培，栽培管理比较好，番茄病毒病发病较轻，发病率大部分在5%以下。這表明栽培管理措施是控制病毒病发生的关键因素。

在德宏州芒市、瑞丽市、陇川县、盈江县4个县市采集了85份番茄样品进行病毒病检测，其中有58份番茄样品带毒，病毒检出率为68.24%，病毒种类有12种。这表明德宏州番茄病毒病种类较多，并且各县市的病毒种类和优势毒源存在较大差异，泰国番茄黄化曲叶病毒是芒市、瑞丽市、盈江县番茄上的优势毒源，TZSV是陇川县番茄上的优势毒源。

研究表明，番茄上的病毒种类有很多[2-7]。由于本试验采集样品数量和检测的病毒种类有限，因而引起本地区番茄病毒病的毒源可能还有其他种类，这还需进一步的检测鉴定。

4    参考文献

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