长链非编码RNA 在精子发生与卵泡发育中的研究进展

高 峰，崔清明，陈 晨，朱 吉，彭英林*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙 410131）

基因组DNA 经过转录可以产生两大类RNA，一类是可以被翻译成蛋白质的编码RNA，另一类是不具有或具有较低编码能力的非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），ncRNA 通常包括非编码小RNA（microRNAs、piRNAs、核仁小分子RNA 等，小于200 nt）和长链非编码RNA（Long noncoding RNA，lncRNA，大于200 nt）[1]。近年来，lncRNA 受到越来越多国内外研究学者的关注，更多的功能作用也被揭示。

精子发生与卵泡发育在动物繁殖活动中起着至关重要的作用，对重要经济动物的使用年限、产仔性能等有较大影响。本文主要介绍了lncRNA 的基本特征及作用机制，论述了lncRNA 对精子发生和卵泡发育的调控机制，并对lncRNA 未来的研究进行展望，为lncRNA 方面的研究提供参考。

1 lncRNA 主要特征及作用机制

根据染色体上编码基因的相对位置，将lncRNA 分为正义链（sense）、反义链（antisense）、双向（bidirectional）、基因间（intergenic）、内含子间（intronic）[2]。根据lncRNA 功能所涉及的分子机制又可分为信号原型、诱饵原型、导向原型、支架原型[3]。lncRNA 约为100～100 000 个碱基，并且经常通过RNA 聚合酶II/III 进行转录[4]。一般来说，lncRNAs 的基因转录水平低于蛋白质编码基因，序列保守性差[5]。然而，保守性差并不一定意味着缺乏功能，正如保守性很差的lncRNA Xist 转录本在印迹和X 染色体失活的调控中发挥关键作用。

lncRNA正在成为细胞生物学领域的主要研究对象，其数量可能超过蛋白质编码的转录物。许多研究表明lncRNAs 起着重要的调控作用，在多种层面上通过多种作用机制调控基因的表达水平，包括染色质修饰[6]、基因组印迹[7]、转录[8]、转录后调控[9]和翻译[10]等。根据其作用方式大致分为3 类：一类是染色质水平，通过对染色质进行表观修饰调节基因表达；第二类是转录水平，通过改变介导基因表达调控相关因子及酶类的功能，从而调控基因表达；第三类是转录后水平，通过与编码基因或者miRNA 结合，从而调节mRNA 和miRNA 的表达水平[11]。

在哺乳动物和其他脊椎动物中已鉴定出数千个lncRNAs，一些lncRNAs 已经被广泛研究，从而揭示了它们可能具有的功能。lncRNAs 的功能通常表现为3种类型的相互作用：RNA-RNA、RNA-DNA 和RNA-蛋白质，所有这些都取决于作用位点的不同[12]。例如，lncRNA 可通过将染色质修饰复合物引导到特定的基因组位点（如Xist）参与各种表观遗传调控。lncRNA 还参与转录水平的基因表达的控制。lncRNA 还可直接与转录因子相互作用，作为诱饵或抑制剂与靶DNA 序列结合。例如，2 种lncRNA 分子Lethe 和p50 相关的Cox-2 基因外RNA（PACER）已经显示出与NF-kB 的不同亚基相互作用，从而阻止它与靶基因的启动子区域结合[13]。lncRNA 还可通过与选择性剪接和染色质结构调节等生物过程中的蛋白质配偶体相互作用来调控基因的表达。

2 lncRNA 调控精子发生

雄性的生殖效率在畜牧生产的经济效益中起着关键作用，精子发生是一个连续而又复杂的高度协调的细胞逐步增殖、分化的过程，主要包括精原细胞增殖、精母细胞减数分裂以及精子成熟3 个阶段，每一阶段都受到多种因素的精密调控，而且需要相关基因的适时表达，才能保证精原细胞顺利分化为精母细胞，最终转变为精子。在基因表达层面主要通过内源性、相互性、外源性3 个层次对其进行调控。内源性调控在其中起关键性作用，相互性调控以支持细胞间的相互性调节为主，而外源性调节主要依靠卵泡刺激素和睾酮等内分泌因素的调节[14]。有研究表明，ncRNA 参与进行精子形成过程的调控[15]，但是精子发生过程的调控机制目前还未完全清楚[16]。最近研究表明，lncRNA 在哺乳动物睾丸发育和精子发生中是动态调控的，lncRNA 可能通过遗传和表观遗传机制，在转录和转录后水平调控基因表达[17]。lncRNA 虽然已经在人类[18]、小鼠[19]和猪[20]的睾丸中发现，然而对其在精子发生过程中的功能还是知之甚少，因此对lncRNA在精子发生过程中的研究具有重要意义。

Nakajima 等[21]从体外小鼠胚胎干细胞诱导生殖细胞后激活的早期反应基因的筛选中分离出含有SINEB1F 基序的长链非编码RNA，命名为R53；并通过原位杂交和northern 印迹分析表明，R53 亚片段RNA 具有B1F 基序，由初级转录物加工，在成年睾丸中表达，并且在精子发生过程中主要定位于减数分裂中期染色质中；此外，注射到小鼠睾丸中的慢病毒介导的RNAi 敲低R53 实验揭示了后期生殖细胞的显著减少和几个后期生物基因的不规则上调，这表明R53 在精子发生过程中对关键基因的转录调控发挥着不可或缺的作用。

Bao 等[22]利用微阵列技术，对小鼠E12.5、E15.5到P7、P14、P21 和睾丸的性腺上中的lncRNA 进行了深入的表达谱分析，发现超过2 000 个lncRNA 在2个相邻时间点的性腺之间差异表达；其对成年睾丸和6 日龄睾丸lncRNA 表达的比较也鉴定出了3 025 个差异表达的lncRNA，并发现出生后小鼠睾丸中的大多数lncRNA 变化似乎与减数分裂过程和精细胞分化同时发生，因为lncRNA 在2 个时间段内发生了超过10 倍的变化（P21 与P14 以及成年与P21），这表明lncRNA的调控在精子发生的减数分裂后期和单倍体时期是最具活力的。

除了以上例子外，还有其他lncRNA 也被发现参与精子发生过程，例如Mrhl[23-25]、Tsx[26]、Dmr[27]和SpgalncRNA[28]等。lncRNA 在睾丸中含量丰富，远远超过了mRNA 的数量和种类，这些丰富的lncRNA 在睾丸中对精子发生的调控机制仍有待进一步探索。

3 lncRNA 调控卵泡发育

卵泡是卵巢的基本功能单位，由位于中间的卵母细胞和四周的颗粒细胞构成。卵泡的发育实际上是卵母细胞和周围的颗粒细胞及卵泡膜细胞互相调控的过程，卵泡发育是一个有序、渐进、复杂的生理过程。在卵泡发育生长过程中，卵泡经历静止期卵泡（始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡）、生长卵泡期（窦前卵泡、早期窦卵泡）、成熟期卵泡（选择卵泡、成熟卵泡）3 个时期，其形态和功能也随着发育时相的变化而不断变化[29]。在卵泡发育的不同阶段，除了卵泡形态和功能发生变化外，其精细调控过程的分子机制还涉及颗粒细胞与卵细胞间的信号传递，同时包括众多的基因/蛋白均参与其中[30]。有研究表明，lncRNA 可通过影响颗粒细胞增殖、分化与凋亡等在排卵、黄体形成和早期胚胎发育等阶段发挥重要作用[31]，因此对lncRNA 的深入研究有助于进一步了解卵泡及早期胚胎发育的分子机制。

李梦寻等[32]采用RACE 技术对lncRNA-ENSSSCT 00000018610 的全长序列进行了扩增克隆，用Realtime PCR 进行组织表达谱分析，分析其在梅山猪和杜洛克猪卵泡中的表达情况并采用顺式和反式2 种方法对lncRNA-ENSSSCT00000018610 靶基因进行预测，克隆获得了lncRNA-ENSSSCT00000018610 全长1 731 bp；lncRNA-ENSSSCT00000018610 在肌肉、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、卵巢、输卵管、子宫、垂体、黄体、下丘脑中均有不同程度的表达，其中肾、肺、子宫、卵巢表达量相对较高；lncRNA-ENSSSCT00000018610 在梅山猪M2 卵泡中的表达量高于S、M1、L 卵泡，在杜洛克猪M1、M2 卵泡中的表达量极显著高于S 和L 卵泡，提示该lncRNA 可能与卵泡发育有关。并且通过lncRNA 与蛋白编码基因表达相关性（co-expression）预测得到其潜在靶基因CYP2J2、SCARB1、HSD3B1、HSD17B2、HSD17B7 参与卵巢类固醇激素合成信号传导，参与卵泡发育及排卵过程，COL11A2、FGFR1、IBSP 参与PI3K-Akt 信号通路，而PI3K-Akt 通路在哺乳动物卵泡发生和排卵的过程中起着关键的调控作用，提示其可能通过对靶基因的调控间接参与卵泡发育过程。

李加宇[33]研究结果显示，在小鼠多种组织中有9个lncRNA 表 达 较 高，其 中lncRNA647、lncR147、lncRNA274 在发情8 周及发情后期卵巢中有特异性高表达；转染lncRNA274 使lncRNA274 过表达发现卵泡发育相关基因上调，排卵次数增多；同时构建以lncRNA274 为靶基因的转基因小鼠，经表型分析，其后代数量明显增加。这些实验结果表明lncRNA274 具有促进排卵、促进卵泡发育的作用。

利用基因工程小鼠模型，York 等[34]研究了一种新的调节因子GAS2 在卵泡发育过程中的体内功能，证明了GAS2 主要表达于卵巢体细胞室，雌性GAS2 缺失小鼠的生殖能力低下，卵母细胞囊肿破裂，窦卵泡和黄体数量减少，生长卵泡周围基底膜组织严重受损。此外，还证实了GAS2 缺失会使卵巢中Notch 信号活性失调，并强调了GAS2 和Notch 信号通路在卵巢发育过程中的相互作用[34]。总的来说，证明了GAS2 在小鼠出生前后卵母细胞囊肿的破裂和后期的卵泡ECM 重建中发挥了不可或缺的作用。

4 展 望

家畜精子发生和卵泡发育等对畜牧业发展起到举足轻重的作用，研究学者已经对精子发生及卵泡发育中相关lncRNA 开始了一系列的研究，尽管目前研究工作大多停留在lncRNA 鉴定上，很多机制研究尚不成熟，但不可否认的是lncRNA 具有多种潜在的重要功能，因此需要深入研究其对家畜繁殖等重要经济性状的调控作用机理，深层次理解家畜繁殖机制，为改善家畜繁殖力提供重要的理论基础。目前对lncRNA 的研究多集中在小鼠上，一些哺乳动物（猪、牛、羊）研究较少，虽然小鼠可作为哺乳动物研究的重要模型，但相同lncRNA 在小鼠中的功能机制是否和在哺乳动物中完全一致还有待研究。