香附挥发油诱导A549细胞凋亡作用

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(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

目前，肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，是世界公认的“癌症之王”。近年来，受城市工业化进程的加速、环境污染和吸烟人群增多等因素的影响，肺癌的发病率呈迅速上升趋势。2015年癌症统计数据显示[1]：中国癌症总发病429.16万例，总死亡281.42万例，2015年全国肺癌发病73.33万例，死亡61.02万例,取代肝癌成为恶性肿瘤之首。如此高的发病率及死亡率表明现有治疗肺癌的药物疗效较差，急需大力研发高效低毒的抗肺癌新药。

香附是常用的中药之一，主要用于治疗肝郁气滞、胸肋胀痛、脾胃气滞和月经不调等病症。活性成分主要为挥发油(含单萜、倍半萜、黄酮类、糖类、生物碱、酚类及三萜类化合物)[2]，其中α-香附酮和α-香附烯为主要成分，占挥发油成分的28.85%[3]。单味香附抗肺癌方面的研究未见报道。本课题组前期研究发现：利用超临界CO2萃取香附挥发油(ACA)，对正常细胞毒性较小，能杀死多种癌细胞。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞株

人肺腺癌细胞A549购自上海中科院细胞所。

1.1.2 试 剂

香附购自杭州中药饮片厂；RPMI-1640培养液、0.25%胰蛋白酶和PBS购自吉诺生物医药技术有限公司；MTT(噻唑兰)、DMSO和Rhodamine123购自SIGMA公司；澳洲胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)购自CLARK Bioscience公司；注射用顺铂(冻干型)购自齐鲁制药有限公司，批号H20023461；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；Fura-2 AM钙离子荧光探针试剂盒、ATP含量测定试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。

1.1.3 仪 器

超临界CO2萃取装置(南通华安超临界萃取有限公司，型号HA221-50-03)；生物安全柜(Nuaire，型号NU-425-400S)；CO2培养箱(Thermo electron corporation，型号NU-5510E)；倒置光学显微镜(Nikon eclipse，型号TS100-FDH1)；多功能酶标仪(BioTek，型号synergy HI)和离心机(Heraeus，型号LDZ5-2)；台式低温高速离心机(Thermo，型号Z36HK)。

1.2 试验方法

1.2.1 超临界CO2装置萃取香附挥发油成分

将香附研磨成粉，取1 kg置萃取釜中，萃取条件：温度55 ℃，压强20 MPa，时间4 h[4]。萃取率计算公式为

萃取率=(ACA质量/原料质量)×100%

1.2.2 MTT法检测细胞活力

收集对数生长期A549细胞，用RPMI-1640培养液(含10% FBS)制成细胞悬液，以103个/孔接种于96孔板，置于37 ℃，5%的CO2饱和湿度培养箱中进行培养24 h。设正常组(RPMI-1640培养液)，不同质量浓度ACA和顺铂(cisplatin, DDP)阳性对照组,每组设6个复孔。药物作用时间分别设置为24，48，72 h。采用MTT法，用多功能酶标仪在490 nm处检测各孔吸光度值，重复实验3次，研究不同质量浓度的药物作用不同时间对A549细胞活力的影响，以确定药物致A549细胞死亡作用及其量-效、时-效关系和IC50(半数致死质量浓度)。细胞抑制率计算公式为

抑制率=(1-OD实验组-OD空白)/(OD正常组-OD空白)×100%

1.2.3 LDH，SOD活性及MDA浓度检测

采用1.2.2方法进行细胞培养及接种。分别设置正常组(RPMI-1640培养液)，不同质量浓度ACA组，每组设6个复孔。药物作用24 h后，收集细胞上清液按照试剂盒说明书检测LDH活性，裂解细胞后按照试剂盒说明书检测MDA浓度及SOD活性，重复实验3次。

1.2.4 Annexin V-EGFP/PI双重荧光染色观察ACA致A549细胞凋亡

细胞培养及接种方法同1.2.2。分别设置正常组(RPMI-1640培养液)、ACA组(经预实验，终质量浓度为140μg/mL)，每组设6个复孔。药物分别作用3，6，12 h后，弃去上清，用PBS清洗3次，每孔分别加入40 μL Binding Buffer+5 μL Annexin V-EGFP室温避光反应15 min，再加入5 μL PI室温避光反应15 min。荧光显微镜下观察、拍照[5-6]。

1.2.5 A549细胞内Ca2+浓度测定

同1.2.2方法进行细胞培养、接种和分组。用不同质量浓度ACA作用24 h后，弃去培养液后，PBS清洗3次。用RPMI-1640培养液将2 mmol/L Fura-2 AM稀释至5 μmol/L，每孔加入40 μL,在37 ℃孵育1 h，激发波长为340 nm和380 nm，发射波长为510 nm，检测荧光强度。用340 nm和380 nm荧光的比值来检测细胞内的Ca2+浓度[7-8]。

1.2.6 A549细胞内ATP浓度测定

取对数生长期A549细胞，以1×105个/孔接种于6孔板内，分别设置正常组(RPMI-1640培养液)，不同质量浓度ACA组，每组设6个复孔。药物作用24 h后,按照试剂盒说明书检测细胞内ATP浓度[9]。

1.2.7 A549细胞线粒体膜电位(Δψ)检测

细胞培养、接种和分组方法同1.2.2。用不同质量浓度ACA作用24 h后，弃去培养液后，PBS清洗3次，加入含10 μg/mL Rh 123的无酚红RPMI-1640培养液，37 ℃孵育30 min，弃去培养液，PBS清洗多次至背景较浅，加入适量无酚红RPMI-1640培养液，荧光显微镜观察、拍照。多功能酶标仪检测荧光值，激发波长为488 nm，发射波长为530 nm[10]。

1.2.8 统计学分析

采用GraphPad Prism软件处理实验数据，数据用(Mean±SD)表示，采用One-way ANOVA检测均数差异显著性，以P<0.05为差异有显著性意义。

2 实验结果及分析

2.1 超临界CO2装置萃取ACA

萃取获得棕黄色油状液体，萃取率为1.045%。

2.2 ACA对A549细胞的毒性作用

2.2.1 A549细胞形态学改变

细胞形态变化(×200)见图1,正常组随时间延长细胞数量增多，形态呈扁平不规则多角形。不同质量浓度ACA组，随质量浓度增加，作用时间延长，细胞数量逐渐减少，形态变圆，细胞膜皱缩，出现膜泡样变、体积缩小、核固缩，表现凋亡特征性变化，最终解体。本结果提示ACA诱导A549凋亡的可能性，将在后续研究中进一步确定。

图1 ACA作用24 h致A549细胞形态变化(200倍)Fig.1 ACA induced morphological changes of A549 cells after 24 h (×200)

2.2.2 ACA对A549细胞毒性作用的量-效、时-效关系

顺铂(DDP)属于铂类配合物，是临床上常用的一线抗癌药物，疗效肯定，具有破坏DNA的结构和功能，是一种广谱的细胞周期非特异性抗癌药物，常用于肺癌、前列腺癌和头颈部磷状细胞癌等的治疗，因此选DDP为阳性对照药。

当ACA质量浓度范围在48～286 μg/mL，作用时间分别为24，48，72 h，随着质量浓度的增加和作用时间的延长，A549细胞活力逐渐降低，有明显量-效和时-效依赖关系(图2)。本部分结果发现：1) ACA效能极强，光镜下可见能完全杀死肺癌细胞，远高于DDP；2) 相较正常组，当ACA质量浓度为286 μg/mL，作用24 h时，细胞活力抑制率达99.8%(P<0.001)；作用2 d，200 μg/mL也达同一峰效应；表明ACA杀伤癌细胞起效快,效能强，提示可以用短期冲击治疗；3) 前期实验结果表明,DDP为4 μg/mL，作用72 h,对正常肝细胞活力抑制率为97.9%,已超过临床可接受的毒性范围，因此本研究为比较抗癌效能而采用这一质量浓度；而ACA 140 μg/mL,作用72 h,对正常肝细胞活力的抑制率为50.1%,考虑到肝细胞再生能力强，ACA对正常肝细胞的毒性在可接受范围[4]。结果表明：ACA比DDP更适于肺癌治疗，治疗质量浓度范围以98～200 μg/mL为宜。作用时间为24，48，72 h,ACA的IC50分别为161.47,126.35,72.37 μg/mL，即ACA对肺癌细胞的毒性随着作用时间延长而增大。图2中,与正常对照组(0质量浓度，下同)比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图2 DDP和ACA对A549细胞毒作用的量-效和时-效关系Fig.2 Dose-and time-cytotoxic effect relationship of ACA on A549 cells

2.2.3 ACA诱发A549细胞LDH释放

乳酸脱氢酶(LDH)是细胞内酶，细胞膜受损致LDH漏出，故培养上清液中LDH活性测定可间接反映细胞严重损伤乃至死亡情况。如图3所示，ACA质量浓度依赖性增加，LDH释放增多，最小有效质量浓度为69 μg/mL。该结果与MTT法测细胞活力的实验结果一致。图3中,与正常对照组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 Annexin V-EGFP/PI双重荧光染色观察ACA致A549细胞凋亡

ACA(140 μg/mL)作用不同时间后，经Annexin V-EGFP/PI双重荧光染色(×200)，细胞变化见图4，正常组细胞未着色，ACA作用3 h时细胞呈绿色，提示细胞进入凋亡早期(膜损伤)。6 h时少量细胞呈红绿双染，12 h时大量细胞呈红绿双染，表明这些细胞不可逆死亡。本结果表明：ACA杀伤细胞的主要机制是诱导细胞凋亡，可能少量细胞发生坏死；ACA起效时间短，12 h即可杀死大量癌细胞。

图3 ACA致A549细胞LDH释放Fig.3 Effects of ACA on LDH levels in A549 cell

图4 Annexin V-EGFP/PI双重荧光染色法(200倍)Fig.4 Fluorescence images of Annexin V-EGFP/PI double staining(×200)

2.4 ACA致A549细胞内Ca2+超载

作为细胞死亡信号[11-12]，Ca2+超载能引起氧化应激，激活细胞凋亡的内源性线粒体途径、细胞坏死和自噬过程。Fura-2 AM是一种可以穿透细胞的荧光染料，其进入细胞后可以被细胞内酯酶剪切成水溶性Fura-2，从而被滞留在细胞内，Fura-2可以和钙离子结合，在330～350 nm激发光下产生较强的荧光，在380 nm激发光下则会导致荧光减弱。用340 nm和380 nm这两个荧光比值来检测细胞内Ca2+浓度是国际常用经典方法。

如图5所示，相较正常组，随ACA质量浓度的增加，细胞内Ca2+浓度显著增高(P<0.05，P<0.001)，提示ACA可致细胞内钙超载,参与细胞死亡过程。

图5 ACA致A549细胞Ca2+超载Fig.5 ACA increases Ca2+levels in A549 cells

2.5 ACA致A549细胞氧化损伤

丙二醛(MDA)是脂质过氧化产物，MDA的浓度反映脂质过氧化程度。超氧化物歧化酶(SOD)活性高低则能间接反映细胞清除氧自由基的能力。测定两者可以反映细胞氧化损伤的情况。当细胞抗氧化能力减弱，细胞内活性氧(ROS)堆积，引起的细胞应激反应，是理化因子诱发细胞凋亡的重要触发方式[13]。

如图6所示，随ACA质量浓度渐增，细胞内MDA浓度不断增加，而SOD活力不断下降，表明ACA呈质量浓度依赖性引起A549细胞氧化损伤。图6中，与正常组相比较，**P<0.01，***P<0.001。

图6 ACA致A549细胞氧化损伤作用Fig.6 Oxidative effects of ACA on A549 cells

2.6 ACA致A549细胞内ATP合成减少

如图7所示，与正常组相比较，随ACA质量浓度的增加，细胞内ATP浓度明显减少(P<0.05，P<0.001)，尤其ACA质量浓度为286 μg/mL时，ATP浓度接近为0。说明ACA诱导A549细胞凋亡作用，与其导致细胞能量代谢异常有关。

图7 ACA致A549细胞内ATP合成减少Fig.7 ACA decreases ATP levels in A549 cells

2.7 ACA致A549细胞线粒体膜电位(Δψ)崩溃

线粒体是真核细胞生物能量和代谢的中心，也是在细胞凋亡、信号转导中起关键调节作用的细胞器。不仅线粒体的原发性损伤可诱导细胞的凋亡性死亡和非凋亡性死亡，而且也参与其他信号通路诱发的凋亡进程，因此线粒体也被称为细胞死亡信号整合器(Death signal integrator)[14]。当凋亡信号通过内质网，受体释放Ca2+,并迅速移至线粒体，并被其膜上的钙蛋白摄取，促进线粒体通透性相变孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放。研究证明：氧化、毒素或缺血和缺氧等病理因素所致的内源性细胞凋亡时，首先引起线粒体膜渗透性改变[15]，细胞色素C释放到胞浆[16]，线粒体膜上的氧化呼吸链电子传递中断，氧化磷酸化失偶联，导致ATP合成受阻，基质Ca2+外流，线粒体内膜两侧离子梯度消失，Δψ崩溃。Rh 123为膜电位敏感的亲脂性阳离子荧光染料，能选择性地在活细胞线粒体内聚集，发出黄绿色荧光，其强度可以间接反映线粒体膜电位(Δψ)的高低。

如图8所示，正常组细胞线粒体呈黄绿色，表明细胞线粒体膜完整。相较正常组，当ACA质量浓度达69 μg/mL时，出现线粒体肿胀，如图9所示，相对荧光强度明显下降(P<0.05)。随ACA质量浓度增加，细胞摄取Rh 123能力逐渐下降，相对荧光强度逐渐减弱(P<0.001)，ACA质量浓度达286 μg/mL时线粒体形态已不可见。结果表明：ACA致A549细胞凋亡和致线粒体严重损伤，与MPTP开放导致Δψ崩溃有关；线粒体损伤，激活线粒体凋亡通路，是ACA诱导细胞凋亡的主要分子机制。图9中，与正常组相比较，*P<0.05，***P<0.001。

图8 Rh 123荧光染色(200倍)Fig.8 Fluorescence images of Rh 123 staining(×200)

图9 ACA致A549细胞线粒体膜电位Δψ崩溃Fig.9 Stimulative effect of ACA on Δψ dissipation of A549 cells

3 结 论

实验主要研究ACA体外抗人肺腺癌细胞A549的作用及其机制。实验结果证明ACA对A549细胞有极强杀伤作用，呈良好的量-效和时-效依赖关系。相较临床上常用抗癌药DDP,ACA起效时间短，在高质量浓度下可100%杀死肺癌细胞，杀瘤效能强大，达到了研发抗癌药物希望的极致效果。通过光镜下观察细胞形态，Annexin V-EGFP/PI双重荧光染色观察均证明ACA通过诱导A549细胞凋亡产生抗癌作用。钙超载、氧化应激和能量代谢障碍是细胞凋亡的始发因素，这3种因素相互影响，互为因果。作用机制研究发现ACA致A549细胞发生Ca2+超载,氧化损伤,ATP合成受阻,能量代谢障碍。这3种因素合力，可以解释ACA强力杀瘤作用。能量代谢是线粒体的主要功能,氧化损伤的主要部位也是在线粒体。用罗丹明123检测线粒体膜电位(Δψ)，发现ACA致线粒体膜电位崩溃，证明ACA作用主要靶细胞器是线粒体，通过致线粒体功能丧失,启动内源性凋亡通路致细胞凋亡。结果表明：ACA通过激活内源性凋亡通路，强力诱导细胞凋亡产生抗肺癌作用,在抗肺癌药物开发方面具有良好的前景。