广南底圩茶黄酮提取工艺研究

陈红惠，李霖娜，聂秋月

（文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663099）

底圩茶原产于驮娘江和西洋江发源地的“九龙山”山脉，因最早出产于底圩乡而得名，是云南省广南县地方优良茶树品种，是优质中国名茶之一。底圩茶品质独特，具有品种、品牌、加工、基地和市场等方面的优势，已经成为广南县茶叶产业重要组成部分。

近年来，现代药理学研究发现黄酮类化合物具有较强抗氧化能力，可清除体内自由基，还有抗菌、消炎等作用[1-4]。茶叶中的主要功效成分之一是以茶多酚为主的黄酮类化合物，为考察底圩茶资源可利用性，对广南地区底圩茶中黄酮进行提取，探讨底圩茶黄酮的最佳提取工艺。通过对底圩茶的黄酮成分提取研究，可以为深入开发底圩茶提供技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

底圩茶 购自云南省文山州广南县；芦丁（上海时代生物科技有限公司）；乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠等均为国产分析纯。

1.2 实验仪器

HOC-DZH烘箱（上海恒黔电子科技有限公司）；W201D恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司）；XS225A电子天平（precise仪器有限公司）；V-1100D型可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

将底圩茶粉碎过筛，储存于干燥棕色瓶中备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

准确称取烘至恒量的芦丁20.00 mg，加入少量80%乙醇溶解，定容至100 mL，配制得到浓度为0.20 mg/mL的芦丁标准溶液。

分别准确吸取上述浓度芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL移入50 mL容量瓶中，将上述容量的芦丁标准溶液中各加入80%乙醇至2.0 mL，加入5%亚硝酸钠1.5 mL，摇匀后静置5 min，加入10%硝酸铝1.0 mL，摇匀后放置5 min，再加5%氢氧化钠10 mL，用80%乙醇定容至刻度，摇匀后，放置10 min，同时作空白对照，在510 nm波长处进行测定吸光值，以芦丁的含量为横坐标，吸光值的大小为纵坐标，绘制芦丁标准曲线[5-9]，得到回归方程：y=5.3571x-0.0001，其中：R2=0.9999，表明测定的吸光值与芦丁含量呈良好的线性关系。

1.3.3 样品提取及含量测定

用电子天平准确称取一定量的底圩茶样品，加入一定浓度的乙醇进行提取，冷却、过滤后定容，得测定用样液。吸取一定体积样液按1.3.2法测定吸光度，然后根据回归方程计算样品中黄酮含量。

1.3.4 提取条件的选择

先对影响提取实验的乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间、提取次数这几个因素进行单因素实验[10-16]，然后根据单因素实验结果选择主要因素进行正交实验，确定底圩茶黄酮最佳提取工艺条件，正交实验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对底圩茶黄酮提取效果的影响

准确称取2.00 g底圩茶粉5份，采用料液比为1∶30（m∶v），乙醇浓度为70%，分别在不同温度条件下提取30 min，提取1次，不同温度条件对底圩茶黄酮提取量的影响结果见图1所示。

图1 不同提取温度提取量的影响

一般说来，温度升高能促使溶剂渗透、扩散速度加快，提取物的溶出量也会随之增加，但过高温度可能引起黄酮类化合物结构被氧化破坏导致其提取含量降低。由图1可看出，当提取温度低于70 ℃时，提取黄酮含量随提取温度升高而增加，当提取温度大于70 ℃时，提取黄酮含量随提取温度升高而逐渐下降，所以在70 ℃时底圩茶黄酮提取效果最好，提取量可达22.31 mg/g。

2.1.2 乙醇浓度对底圩茶黄酮提取效果的影响

准确称取2.00 g底圩茶粉5份，在料液比为1∶30（m∶v），提取温度为70 ℃，提取30 min条件下，改变乙醇不同浓度以考察其对底圩茶黄酮提取量影响，结果见图2。

图2 不同乙醇浓度对提取量的影响

一般来说，溶剂浓度越高，提取物浸出量也越多，但过高的浓度也会增加杂质的溶出。由图2可看出，乙醇浓度增加达70%时，黄酮提取量最大，达到20.96 mg/g；然后乙醇浓度再增加，黄酮提取含量却出现减少，故提取底圩茶黄酮的最佳乙醇浓度为70%。

2.1.3 料液比对底圩茶黄酮提取效果的影响

准确称取2.00 g底圩茶粉5份，加入70%乙醇，在70 ℃温度下提取30 min，提取1次，改变不同料液比考察其对底圩茶黄酮提取量的影响，结果见图3。

图3 不同液料比对黄酮提取量的影响

由图3可看出，当料液比小于1∶60（m∶v）时，提取黄酮含量随料液比增加而增加，当料液比超过1∶60（m∶v）时，提取黄酮含量出现下降，所以底圩茶黄酮提取的最佳料液比为1∶60（m∶v），此时的提取含量为27.36 mg/g。

2.1.4 提取时间对底圩茶黄酮提取效果的影响

准确称取2.0 g底圩茶粉5份，提取温度为70 ℃，乙醇浓度为70%，料液比为1∶60（m∶v，分别在提取时间为30、40、50、60、70 min下提取1次，考察不同提取时间对底圩茶黄酮提取量的影响，结果见图4。

图4 不同提取时间对黄酮提取量的影响

由图4可看出，在提取时间低于50 min时，黄酮提取量随提取时间增加而增加，当提取时间大于50 min时，黄酮提取量却下降，因此50 min是提取底圩茶黄酮的最佳时间，此时的提取含量25.96 mg/g。

2.1.5 提取次数对底圩茶黄酮提取效果的影响

准确称取2.00 g干燥的底圩茶粉4份，在提取温度为70 ℃，乙醇浓度为70%，料液比为1∶60（m∶v），提取时间为50 min下分别提取1、2、3、4次，考察不同提取次数对底圩茶黄酮提取量的影响，结果见图5。

图5 不同提取次数对黄酮提取量的影响

从图5可看出，当提取次数小于3次时，随着提取次数不断增加，提取黄酮含量也随着增加，当提取次数大于3次时，提取黄酮含量趋于平衡，由于提取2次时的黄酮含量比提取1次时的高1.12 mg/g，提取3次时的黄酮含量比提取2次时的高0.19 mg/g，再考虑相应的经济成本和工作效率，提取2次远比提取3次好，所以，2次是提取底圩茶黄酮的最佳次数，此时的提取含量26.80 mg/g。

2.2 正交试验优化底圩茶黄酮提取工艺参数

依据以上单因素试验情况，优选提取工艺条件选择乙醇浓度（A）、提取温度（B）、料液比（C）、提取时间（D）4个因素、每个因素，设定3个水平，进行L9（34）正交试验来确定底圩茶中黄酮最佳提取条件[17-21]，正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

从表2中极差R大小可看出，各因素对底圩茶黄酮提取效果影响的大小顺序是：RB＞RA＞RD＞RC，即提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比；最佳的水平组合应为A1B1C1D1即乙醇浓度为60%、温度为60 ℃、料液比1∶50（m∶v）、提取时间为40 min。因此，确定生产底圩茶黄酮的提取工艺条件为：底圩茶叶洗净，60 ℃烘至恒重后，粉碎，用60%乙醇于60 ℃条件下提取2次，每次40 min。

2.3 最佳提取工艺条件的验证

依据正交所得出底圩茶黄酮的最佳提取工艺条件，进行了三次验证实验，结果见表3。

表3 黄酮提取验证实验

由表3可知，在乙醇浓度为60%、温度为60 ℃、料液比1∶50（m∶v）、提取时间为40 min条件下提取2次，黄酮提取含量达36.49 mg/g，均高于其他提取条件下水平的提取含量。

3 结论

本实验对底圩茶黄酮提取工艺进行研究，通过正交实验结果分析可知，影响底圩茶黄酮提取效果的因素中提取温度是最主要的影响因素，其次为乙醇浓度，影响最小的因素是料液比。底圩茶黄酮最佳提取条件为：在料液比1∶50（m∶v）条件下，用浓度为60%乙醇60 ℃下提取40 min，提取2次，在此最优提取工艺条件下，底圩茶黄酮提取含量为36.49 mg/g。本试验对底圩茶黄酮类化合物的提取研究提供理论依据，具有一定指导意义，对底圩茶的进一步深加工具有促进作用，也为底圩茶进一步纯化和活性研究奠定了基础。