生腌熟腌冬瓜挥发性风味成分及指纹图谱分析

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(宁波大学 海洋学院，应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波315211)

蔬菜的腌制是我国传统的蔬菜加工方法，其加工简易，成本低廉，产品易于保存。腌制蔬菜具有独特的色、香、味，是人们餐桌上不可或缺的佐餐食品[1]。冬瓜是一年生攀缘性草本植物，葫芦科冬瓜属，其性甘平，具有清热养胃，荡涤肠内秽物的功效，为夏秋季主要蔬菜之一；冬瓜中含有蛋白质、糖、粗纤维、钙、胡萝卜素、核黄素、磷、烟酸、维生素C、蛇麻脂醇、甘露醇、β-谷甾醇等营养及功能成分，冬瓜中除含有17种常见氨基酸以外，还含有鸟氨酸和γ-氨基丁酸，是果蔬中唯一不含脂肪的食品。腌制冬瓜，俗称臭冬瓜，是浙江东部地区深受人们喜爱的传统发酵食品，近年来作为“家乡菜”“特色菜”身价倍增。在浙东地区民间有不同的加工方法，引起产品的口感、风味带来差异，但对其化学成分的差异性未能深入认识，从而影响工业化生产工艺的建立。

气相色谱-质谱联用(GC-MS)在食品质量和安全控制方面有很重要的应用[2]。运用GC-MS分析方法对在鱼腥草、椒样薄荷、杏鲍菇、杏叶、香茅草、胡椒花等挥发性成分已有研究报道[3-8]。然而，GC-MS分析方法结合指纹图谱技术在食品领域中的应用还不是很普遍, 它可对食品质量和风味等的鉴定提供参考数据。斯林林[9]用GC-MS指纹图谱研究山苍子油化学成分。李育钟[10]利用GC-MS色谱指纹图谱研究皱皮木瓜有机酸提取纯化的工艺。孙莲等[11]建立新疆芜菁子药材挥发油的GC-MS指纹图谱,为芜菁子药材的质量评价和鉴定提供基础数据。阿吉姑·阿布都热西提等[12]建立了新疆巴旦杏仁油脂肪酸成分的GC-MS指纹图谱。而固相微萃取技术(简称SPME)作为一种简单、快速、方便的样品前处理技术其最小检测限可在10-12～10-9数量级，近年来国内外学者采用SPME技术应用于环境(水、土壤、大气)、食品、天然产物、制药、生物、毒理和法医学等多个方面[13]。如利用固相微萃取技术、SPME-GC/MS联用技术等对蟠桃鲜果、陈皮、脆肉鲩鱼肉、苦荞、乳和番茄、新疆风干牛肉、草莓和精武鸭脖的挥发性成分做了分析[14-22]。结合气味指纹图谱方法能较好地反映食品中挥发性气味物质与其品质变化的关联性。前期研究表明[23]，采用同时蒸馏萃取(SDE法)和顶空固相微萃取(HS-SPME法)萃取腌制冬瓜挥发性成分，其种类和相对含量的结果具有较大的差异性，采用后者的方法能更全面反映腌冬瓜的挥发性成分。袁晓阳等研究了自然发酵腌冬瓜的菌种多样性及其主要风味成分[24]，其中检测到的挥发性风味成分包括丁酸、己酸和戊酸等，大多具有不愉快的气味。

本文利用SPME和GC-MS分析技术，研究低盐条件下浙东地区两种典型的冬瓜腌制方式(生腌和熟腌)其挥发性风味物质成分的差异性，并构建和比较不同加工方式其挥发性风味成分的指纹图谱，以全面了解各种腌冬瓜产品的风味差异性，揭示浙东地区特色腌冬瓜产品风味特征，为促进传统腌冬瓜加工产业技术升级，提高人们饮食健康与食品营养等提供依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

浙东老冬瓜一只(购于宁波市菜市场)，食用盐。

1.2 主要仪器

瓷坛、研钵、电磁炉、手动SPME 进样器，15毫升顶空瓶；电子称：上海民桥精密科学仪器有限公司；PDMS 75 μm萃取头：Supelco公司；GC-MS仪：QP2010，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 冬瓜腌制工艺流程

具体操作方法根据前期方法进行[25]。

1.3.2 样品的分析方法

样品的准备：在生腌冬瓜坛和熟腌冬瓜坛中分别取样,将样品混合均匀捣碎。分别准确称取2 g样品液置于15 mL顶空样品瓶中，盖上含隔垫的盖子，置于恒温水浴锅中保温15 min。

生腌和熟腌样品瓶分别制备两个，将固相微萃取器的萃取针头通过瓶盖的橡皮垫插入样品瓶中,推出纤维头(注意不要使萃取头碰到品) ,于50 ℃恒温吸附40 min,抽回纤维头并拔出萃取针头。迅速将萃取针头插入气相色谱仪进样口,推出纤维头,于250 ℃解析10 min,抽回纤维头后拔出萃取头,同时启动仪器采集数据。

样品的GC-MS分析： 色谱条件：日本岛津GCMS-QP2010，色谱柱为VOCO1 0.32 mm×1.8 mm×60 cm载气为高纯氮气，不分流进样；起始温度35 ℃，保持3 min，再以3 ℃/min升温至40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持25 min。

质谱条件：电离源为EI或CI，离子阱温度150 ℃，GC-MS传输线温度250 ℃，质谱扫描范围45～1 000 amu，EI电子能量为70 eV。

2 结果与分析

2.1 不同腌制冬瓜样品挥发性成分的鉴定及种类和含量分析

2.1.1 腌制冬瓜样品的气相色谱分离图谱

两种不同腌制方法(生腌和熟腌)腌制出的冬瓜其挥发性风味化合物通过气相色谱法进行分析测定，结果如图1和图2所示。

图1 生腌冬瓜样品挥发性成分的气相色谱图

图2 熟腌冬瓜样品挥发性成分的气相色谱图

2.1.2 生腌冬瓜挥发性成分的SPME-GC/MS鉴定结果及各化合物的相对含量

对总离子流色谱图中各色谱峰经质谱扫描后得到质谱图, 经过质谱数据库检索, 人工谱图解析, 按各色谱峰的质谱图与文献核对, 并查对有关质谱文献, 确定出生腌冬瓜的风味物质组成, 并应用峰面积归一化法确定它们的相对含量, 结果如表1、表2所示。

表1列出了相似度高于80的物质。通过表1可以看出,生腌冬瓜挥发性物质类别主要以醇类物质为主。其中共鉴定出醇类物质14种,烯类物质12种,烷烃类物质9种,醛类10种，酸类物质12种，酯类物质7种；除此之外,还有少量醚、酮类、炔烃类物质和其他物质。各类挥发性物质数量及含量占总挥发性物质的比例如表2所示。

表1 生腌冬瓜的挥发性成分及其相对含量

表2 生腌冬瓜主要挥发性物质的相对含量

由表2可以看出，醇类物质是构成生腌冬瓜挥发性成分的主要物质，其相对含量占总挥发性成分含量的46.70%；烯烃和酯对生腌冬瓜挥发性成分的贡献仅次于醇类,烯烃类物质种类多于酯类物质,但其相对含量却远低于酯类,其含量占总量的10.51%，酯类物质含量占总量的26.63%。醇类物质中,异戊醇含量较高,为17.54% ,占醇类物质含量的37.56% ,乙醇相对含量为22.12% ,其它醇含量均较低；酯类物质中，以乙酸乙酯的含量较高，其相对含量为89.6%，其余物质的相对含量较低；烯烃类物质中以(Z)-2-庚烯含量较高,其余含量均较低,且含量相当；烷烃中三硅氧烷为主,其余含量均较低,且含量相当。

2.1.3 熟腌冬瓜挥发性成分的SPME-GC/MS鉴定结果及各化合物的相对含量

对总离子流色谱图中各色谱峰经质谱扫描后得到质谱图, 经过检索与核对,确定出熟腌冬瓜的风味物质组成, 并应用峰面积归一化法确定了它们的相对含量, 结果如表3和表4所示。

表3列出了相似度高于80的物质。通过表3可以看出,熟腌冬瓜挥发性物质类别主要以烯烃类物质为主。其中共鉴定出醇类物质10种,烯类物质8种,烷烃类物质13种,醛类14种，酸类物质14种；除此之外,还有少量呋喃、酯类、酮类和其他物质。各类挥发性物质数量及含量占总挥发性物质的比例见表4。

表3 熟腌冬瓜的挥发性成分及其相对含量

续表3

表4 熟腌冬瓜主要挥发性物质的相对含量

由表4可以看出,烯烃类物质是构成熟腌冬瓜挥发性成分的主要物质,其相对含量占总挥发性成分含量的61.71%；酯类物质和醇类物质对熟腌冬瓜挥发性成分的贡献仅次于烯烃类,酸类和醛类物质种类多于烯烃类物质,但其相对含量却远低于烯烃类,其含量分别占总含量的10.82%，8.5%，4.07%，7.09%；烷烃与酮类物质对冬瓜香味也具有一定贡献。烯烃类物质中,2,4-戊二烯含量较高,为47.46% ,占烯烃类物质含量的76.91% ,庚烯相对含量为9.25% ,其它烯烃类物质含量均较低；酯类物质中以乙酸乙酯含量较高,为10.71%，其余含量均较低,且含量相当；烷烃中以3-亚甲基-庚烷为主,相对含量分别为2.1%；2-乙基-1-己醇是构成冬瓜香味的主要醇类物质, 相对含量为4.07%。

2.1.4 生腌冬瓜和熟腌冬瓜主要挥发性成分及其相对含量的对比

由生腌冬瓜和熟腌冬瓜的挥发性成分可以看出，生腌冬瓜中醇类物质是构成挥发性成分的主要物质，而在熟腌冬瓜中，烯烃类物质是构成挥发性成分的主要物质。

在生腌冬瓜的挥发性成分中，其相对百分含量较高的7种物质分别是乙醇(10.33%)、乙酸乙酯(23.86%)、异戊醇(17.54%)、2-甲基-1-丁醇(8.49%)、3-甲基-1-丁醇(7.03%)、(Z)-2-庚烯 (5.98%)、2,4-戊二烯(2.46%)，7种化合物的总含量占所有化合物75.69%。

在熟腌冬瓜的挥发性成分中，其相对百分含量较高的7种物质是：乙酸乙酯(10.71%)、2,4-戊二烯(47.46%)、庚烯(9.25%)、2-乙基-1-己醇(4.07%)、2-辛烯(4.12%)、戊醛(2.42%)、3-亚甲基-庚烷(2.1%)，7种化合物的总含量占所有化合物的80.13%。

2.2 色谱指纹图谱的建立与分析

2.2.1 生腌冬瓜的色谱指纹图谱的建立与分析

对生腌冬瓜的两组样品进行测定, 共鉴定出挥发性成分77种, 主要成分是醇类、烯类和酯类等化合物。从中选取11个共有峰作为可以构成生腌冬瓜风味的特征指纹峰, 共有指纹峰的峰面积占总峰面积72.84%。以乙烷(保留时间为7.595 )内标峰为参照峰求出共有指纹峰的相对保留值和相对峰面积Sr值，并按相对保留值的大小顺序列表(表5) , 建立起生腌冬瓜的色谱指纹图谱(图3)。

表5 两组生腌冬瓜的色谱指纹图谱中特征峰的相对保留值和Sr值

图3 生腌冬瓜的色谱指纹图谱

两次鉴定的生腌冬瓜的总离子流色谱图既有相似的特征, 又有差别。他们的挥发性成分的色谱峰基本相同, 但每个峰的含量却有所不同，第一次鉴定中，1、2、3、4、5峰的相对百分含量均较大。第二次鉴定中，6、7、8、9、10、11峰的相对百分含量较大。两次鉴定中第5峰处的峰都较密集, 而且其百分含量差异性不大。

由表5可以看出, 2,4-戊二烯、3-甲基-1-丁醇、(Z)-2-庚烯的相对百分含量存在着一定的差异，二次鉴定中的含量较高, 而一次鉴定中的含量较低, 其余化合物的相对百分含量则差异不大。

2.2.2 熟腌冬瓜的色谱指纹图谱的建立与分析

对熟腌冬瓜的两组样品进行测定, 共鉴定出挥发性成分77种, 主要成分是烯烃类和酯类等化合物。从中选取了7个共有峰作为构成熟腌冬瓜风味的特征指纹峰, 共有指纹峰的峰面积占总峰面积79.73%。以戊醛(保留时间为15.593)内标峰为参照峰求出共有指纹峰的相对保留值和相对峰面积Sr值，并按相对保留值的大小顺序列表(表6) , 建立起熟腌冬瓜的色谱指纹图谱(图4)。

表6 两组熟腌冬瓜的色谱指纹图谱中特征峰的相对保留值和Sr值

二次鉴定的熟腌冬瓜的总离子流色谱图既有相似的特征又有差别，他们的挥发性成分的色谱峰基本相同, 但每个峰的含量却有所不同，第一次鉴定中，1、5、6、7峰的相对百分含量均较大；第二次鉴定中3、4、6峰的相对百分含量较大。两次鉴定中第二次鉴定的峰较密集, 但其百分含量差异性不大。

2.2.3 生腌冬瓜和熟腌冬瓜色谱指纹图谱的对比

综上可知，在两次鉴定中，生腌冬瓜的共有峰多于熟腌冬瓜的共有峰，生腌冬瓜有11个共有峰，而熟腌冬瓜有7个共有峰，且生腌冬瓜中第5峰处的峰都比较密集，而熟腌冬瓜的共有峰则分布相对均匀。

在生腌冬瓜中，2,4-戊二烯、3-甲基-1-丁醇、(Z)-2-庚烯的相对百分含量存在着一定的差异，且差异性较大，但熟腌冬瓜中各化合物的相对百分含量的差异性不大，说明熟腌冬瓜的挥发性化合物相比生腌冬瓜的挥发性化合物较稳定。

图4 熟腌冬瓜的色谱指纹图谱

3 讨 论

研究表明冬瓜两种腌制过程挥发性成分存在较大差异，生腌冬瓜以醇类相对含量最高占46.7%，其次为酯类占26.6%；而熟腌工艺相对含量最高为烯烃类占61.7%，其次是酯类、醇类和醛类相对含量较接近，在10%左右；这与腌制操作方式密切相关。对于生腌工艺，生鲜原料直接经清洗后，其中带有的各种各样微生物包括耐热和非耐热微生物，根据冬瓜原料的营养成分及其环境条件，通过微生物在食品介质的消长规律进行，产生特有的微生物菌相，而这些微生物种群与产品质量密切相关。在前期研究中，沈锡权等[26]发现，以生腌方式腌制冬瓜，开始阶段其优势细菌种类为肠杆菌属、乳球菌属和魏斯氏菌属，到腌制中期阶段，微生物多样性相对稳定，主要优势细菌有片球菌属、魏斯氏菌属和枝芽孢杆菌属。这些种群由于代谢途径包括有机酸、醇等代谢产物的差异性最后影响到腌冬瓜的风味成分，从而形成生腌冬瓜的特定品质。

相对熟腌加工工艺，冬瓜原料经过约5分钟时间的煮沸，其中不耐热微生物包括酵母菌和细菌显著减少，从而大大影响起始阶段的微生物种群及其数量。赵永威等采用分子生物学方法研究了冬瓜熟腌工艺微生物的多样性[27]，发现冬瓜腌制开始时优势种群为不动杆菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属；这与生腌工艺中除了细菌魏斯氏菌属相同外，微生物种群产生较大的差异性；在腌制中期至后期存在的部分菌种乳杆菌属和葡萄球菌属与生腌菌属存在差异性；不同菌种的发酵体系必然引起代谢产物的差异性，其中的有机酸、醇类通过后熟阶段形成多种挥发性成分。另外，腌制冬瓜中存在重要微生物乳酸菌、酵母菌通过代谢形成乳酸及抗菌成分对维持产品的菌属稳定性具有重要意义。张庆峰等[28]通过接种复合乳酸菌的新型冬瓜腌制工艺，通过接入乳酸菌后相比于自然腌制冬瓜，发酵稳定后其乳酸菌和细菌总数明显提高达1个数量级，产品含有的氨基酸总量和必需氨基酸含量相对提高；其挥发性成分的种类及含量与对照组有较高的相似度，其中酯类和醛类物质相对含量分别提高了10.00%和29.88%。综上所述，产生这此结果的原因与微生物种群变化有密切的关系。张胜男等[29]通过筛选优良乳酸菌用于提高腌制茭白的品质同样证明了这些观点。而孙丽等[30]考察了熟腌冬瓜加工过程酵母菌的多样性，其中检测到的优势酵母菌为普鲁兰类酵母和热带假丝酵母，而普鲁兰类酵母能促进部分乳酸菌生长，热带假丝酵母抗逆性强，能代谢木糖产生乙醇，这些种群通过不同的代谢方式产生多种挥发性成分对产品风味的形成发生重要影响[31]。

4 结 论

腌制冬瓜所采用的工艺不同，其挥发性成分和指纹图谱也有所不同。生腌冬瓜的挥发性风味物质主要由醇类物质和酯类物质构成。醇类物质的相对含量占总含量的46.70%，其中乙醇相对含量为10.33%，异戊醇相对含量为17.54%，2-甲基-1-丁醇相对含量为8.49%。酯类物质相对含量占总含量的26.63%，其中乙酸乙酯的相对含量为23.86%。熟腌冬瓜的挥发性风味物质主要由烯烃类和酯类物质构成。烯烃类物质相对含量占总含量的61.71%，其中2,4-戊二烯相对含量为47.46%，庚烯相对含量为9.25%。酯类物质相对含量占总含量的10.82%，其中乙酸乙酯的相对含量为10.81%。生腌冬瓜和熟腌冬瓜中酯类物质的含量都位居第二，说明不论在生腌冬瓜还是熟腌冬瓜中，酯类物质都是腌制冬瓜的挥发性风味物质的一个重要组成部分。

由生腌冬瓜的色谱指纹图谱可以看出，生腌冬瓜中2,4-戊二烯、3-甲基-1-丁醇、(Z)-2-庚烯的相对百分含量存在着一定的差异，且差异性较大。而由熟腌冬瓜的色谱指纹图谱可以看出，熟腌冬瓜中的各挥发性物质的百分含量差异性都不大，这说明，熟腌冬瓜相对于生腌冬瓜其挥发性风味物质更加稳定。