环磷酰胺构建动物免疫抑制模型的研究进展

伍维高,钟金凤

(湖南环境生物职业技术学院,湖南 衡阳 421005)

近几年来,动物疫病肆意流行,免疫接种成为预防传染病的有效措施之一,而免疫反应过程相当复杂,诸多因素会影响接种效果,如免疫抑制性疾病、不良的饲养环境、微量元素和蛋白质的缺乏等,常导致免疫接种失败,给生产带来不可挽回的重大损失。为提高机体抗病力,增强动物免疫力,免疫增强剂得以广泛运用。为了进一步研究此类制剂,人为构建免疫抑制模型的研究手段得到了诸多研究者的青睐。而环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX),以其诱导动物产生免疫抑制作用效果显著,且成本低廉,越来越广泛地运用到制备动物免疫抑制模型中。为此,本文对环磷酰胺构建免疫抑制模型进行综述。

1 环磷酰胺的药理作用

经口服或静脉注射的环磷酰胺主要在肝脏进行代谢,生成低毒性的4-羟基环磷酰胺和醛磷酰胺,分布全身,进一步降解为磷酰氮芥、丙烯醛和去甲氮芥,结合于快速生长细胞的DNA上,产生强烈的细胞毒性。极少部分可进一步氧化成4-酮环磷酰胺和羧基环磷酰胺,无毒性,随尿排出[1]。

2 CTX免疫抑制机理

2.1 环磷酰胺对免疫基因的影响

2.1.1 抑制抗菌蛋白基因表达 内源性抗菌蛋白是天然免疫的重要组成部分,其中杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein,BPI)、防御素(Defensins,DF)以及血小板型磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)备受关注[2]。大鼠连续5 d腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg·bw,对照组注射等体积生理盐水,结果显示,对照组大鼠的睾丸、附睾、胸腺、肝、小肠、大肠6种器官均表达BPI、β-DF-1、血小板型PLA2;而环磷酰胺组胸腺、肝无BPI表达,睾丸、胸腺、肝无β-DF-1表达,睾丸、胸腺无血小板型PLA2表达,其他有表达的组织中其含量比对照组低[3],试验提示,环磷酰胺可抑制体内抗菌蛋白基因表达。

2.1.2 影响免疫相关基因的表达 环磷酰胺对免疫相关基因有一定影响。经环磷酰胺处理的荷瘤鼠脾脏、骨髓和血浆相关多种免疫调节因子基因上调,包括危险信号、模式识别受体、炎症介质、生长因子、细胞因子、趋化因子和趋化因子受体[4]。通过基因芯片技术检测环磷酰胺干预的胚胎干细胞发现：自体免疫激活和移植排斥相关基因如CD3、CD28、CTLA4、MHC II、PRF1、GZMB 和 IL-2R 基因下调,而免疫相关受体基因如IL1R2、IL18R1和FLT3上调[5]。

2.2 环磷酰胺对动物转录水平的影响

2.2.1 抑制骨髓细胞相关mRNA表达 环磷酰胺诱导骨髓抑制,造成骨髓细胞(BM)降低。雄性昆明种小鼠连续3d腹腔注射150 mg/kg·d环磷酰胺,7 d后采骨髓细胞通过Real time PCR检测发现,试验组BM细胞钙敏感受体(Calcium-sensing receptor,CaSR)和丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)mRNA水平极显著高于对照组(P＜0.01),引起BM造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞增殖、分化和动员产生明显障碍[6]。

2.2.2 调节细胞凋亡相关mRNA表达 环磷酰胺对细胞凋亡的影响主要体现在两方面：增加促凋亡基因mRNA表达而抑制抗凋亡基因mRNA表达,从而诱导细胞凋亡。SPF级NIH雄性小鼠于试验期第9、11、13天腹腔注射环磷酰胺 10 mg/kg,于 14 d、28 d取脾脏采用半定量RT-PCR检测促凋亡基因-Caspase-9 mRNA和抗凋亡基因-B淋巴细胞基因2(B-cell lymphonma gene 2,BCL-2)的表达,两次结果均显示,模型组Caspase-9 mRNA表达较对照组显著升高而BCL-2 mRNA表达显著降低[7]。8～12周远交系昆明种小鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg,1次/d,连续3 d,第10天取小鼠脾脏测定凋亡相关基因,结果显示,BAX(Bcl-2 associated X protein)mRNA表达水平明显上升,而BCL-2 mRNA表达明显下降[8]。

2.2.3 降低免疫相关受体mRNA表达 环磷酰胺可降低免疫相关受体mRNA的表达。树突状细胞相关C-型凝集素-1(Dectin-1)和Toll样受体(Tolllike receptor,TLR)主要表达在免疫细胞上,为免疫相关受体,与免疫状态有关[9]。给予150 mg/kg环磷酰胺的BALB/c小鼠与第4、7、9天取肺组织测定Dectin-1 mRNA,结果显示,在第4、7天肺组织Dectin-1 mRNA表达较对照组明显下降(P＜0.05)[10]。24只昆明种小鼠(雌性)腹腔注射环磷酰胺150 mg/kg,4 h后肺泡巨噬细胞TLR2 mRNA表达与对照组相比极显著下降(P＜0.01);8 h后TLR4 mRNA表达极显著降低(P＜0.01)[11]。

2.2.4 影响免疫因子mRNA表达 环磷酰胺对Th1、Th2类细胞因子mRNA表达均有不同程度影响。汪祯等[12]用SPF级昆明种小鼠按50 mg/kg·bw剂量隔日腹腔注射环磷酰胺,共7次,14 d后,无菌取脾脏测定IL-2 mRNA、IL-10 mRNA,结果显示,IL-2 mRNA、IL-10 mRNA表达水平与对照组相比显著下降;易有金等[13]腹腔注射40mg/kg·d环磷酰胺,结果显示,脾脏和胸腺中 IL-2、IL-10、IL-12、IL-4、TNF-α和IFN-γ mRNA的表达量降低,以上试验提示,环磷酰胺对Th1、Th2类细胞因子表达均呈现下调现象[14]。

2.3 环磷酰胺对动物蛋白水平的影响

2.3.1 抑制细胞周期相关蛋白表达 环磷酰胺降低着丝粒蛋白B(Centromere Protein,CenpB),CenpB是染色体着丝粒/动粒复合体上一种最重要的功能蛋白,其特异性结合位点位于着丝粒 α1-卫星DNA上17 bp的CenpB盒,参与着丝粒异染色质的形成,环磷酰胺可致CenpB蛋白含量异常,致细胞无法正常分裂。昆明种小鼠连续7 d腹腔注射50 mg/kg·bw环磷酰胺,5 d后取血通过Western Blotting方法检测 CenpB蛋白,其含量显著低于对照组[15]。

2.3.2 增加细胞凋亡相关蛋白表达 环磷酰胺可通过增加细胞凋亡蛋白的表达影响Fas/Fas L系统介导的凋亡蛋白。SPF级ICR纯种雄性小鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg·bw,用流式细胞术检测Fas抗原(CD95)介导细胞凋亡的蛋白,其表达量与对照组相比显著升高[16]。人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat加入环磷酰胺 3 mg/L,于12、24、48 h 收取细胞,Western Blot检测FasL(Fas ligand,fas配体)和FADD(Floationg Point Addition,胞浆死亡信号衔接蛋白)表达,结果表明,未处理的细胞无 FasL和FADD表达,而环磷酰胺处理组表达FasL和FADD,且表达水平随环磷酰胺刺激时间延长而增加[17]。除此,环磷酰胺能显著诱导Fas/Fas L下游蛋白Caspases产生[18],使凋亡不可逆进行。

3 环磷酰胺在动物上的应用

因环磷酰胺主要作用于快速生长细胞的DNA,并能从基因转录、翻译和蛋白表达等多方面产生细胞毒性。免疫细胞属于快速生长细胞,因此,环磷酰胺对免疫系统影响甚大,故可用环磷酰胺作为免疫抑制剂构建免疫抑制模型,这是环磷酰胺在动物上的主要用途。

3.1 环磷酰胺抑制动物免疫器官 在环磷酰胺作用下鸡表现出形态退行性改变,包括腔上囊囊泡不发达,即腔上囊初级滤泡严重萎缩,皮质和髓质间隔不明显且滤泡间结缔组织严重增值[19]。Marsh J研究发现,脾脏内正常椭球相关细胞在环磷酰胺作用后1周变为空泡[20]。

3.2 环磷酰胺降低动物免疫细胞数量 连续3 d给7～8周龄雌性尼古拉斯火鸡注射环磷酰胺(0～100 mg/kg·bw),测定血液学指标发现,环磷酰胺在初始注射后24～72 h引起明显的白细胞减少、淋巴细胞减少、血小板减少和白细胞减少。但对单核细胞循环数、细胞体积、血浆蛋白无明显影响。同时,无法确定对嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的变化,因为它们在机体内的数量微量[21]。

3.3 环磷酰胺减少免疫分子产生 研究表明,环磷酰胺可减少免疫分子产生：用80 mg/kg·bw环磷酰胺腹腔注射小鼠,同位素标记法显示24 h和48 h其肠道蛋白损失显著高于对照组,连续2 d注射环磷酰胺(50 mg/kg·bw),可造成肠黏膜SIgA损伤,肠道固有层IgA表达量减少[22]。环磷酰胺(10 mg/kg·bw)与单剂量长春新碱(0.025 mg/kg·bw,静脉注射)和单剂量的 L-天冬酰胺酶(400 IU/kg·bw,静脉注射)同时注射狗,3 d后抗体反应受抑制[23]。

环磷酰胺在抑制免疫系统的同时,其他新陈代谢旺盛的组织如胃肠、毛发等亦会受影响,因此,用环磷酰胺造模的同时,动物可出现采食量降低、生长性能受阻、毛发脱落等现象[24-25]。

4 小结

环磷酰胺主要作用快速生长细胞DNA,并从基因水平、转录水平和蛋白水平影响免疫系统,它可下调抗菌蛋白基因、免疫相关基因的表达,增加促凋亡基因mRNA和抑制抗凋亡基因mRNA转录,降低着丝粒蛋白B含量,抑制细胞正常分裂;诱导促凋亡蛋白Caspases产生,促使凋亡不可逆进行,从而广泛引起细胞周期改变、诱导细胞凋亡发生,最终表现出免疫器官、免疫细胞和免疫分子的现象,可广泛应用在动物免疫抑制模型上。