利用深度测序和单个B细胞PCR技术解析猪流行性腹泻病毒免疫后的猪抗体谱

研究进展评述

猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染主要引起10 日龄内新生仔猪呕吐、水样腹泻和严重肠炎，导致高致病率和高死亡率，是目前引起我国新生仔猪腹泻的主要病原，每年给我国养猪业造成重大的经济损失。预防PEDV 感染主要通过B 细胞产生的抗体免疫应答，特别是肠道黏膜局部抗体的免疫应答。大量文献已经证实PEDV 感染或免疫接种怀孕母猪通过乳汁能够保护刚出生的哺乳仔猪，明显减轻仔猪的临床症状和死亡率，并发现仔猪的被动免疫保护和初乳、母乳中的中和抗体水平最相关。因此如何诱导高水平的保护性抗体是制定科学的免疫程序和设计下一代新型疫苗必须回答的科学问题。

机体免疫应答的强大就在于其产生抗体的多样性。机体B 细胞能够产生高达1013不同特异性的抗体，这些不同特异性抗体形成一个抗体谱。抗体特异性主要由抗体可变区决定。抗体重链可变区由VH、DH 和JH 3 种不同基因片段重排形成，轻链可变区由VL 和J 两个不同基因片段组成。每个基因片段在胚系基因中均存在多个不同的等位基因片段。然而抗体基因的使用并不是完全随机的，存在一些优势基因。抗体谱除了受遗传基因决定外还受所接触的抗原的影响。抗体谱分析正成为评价机体抗体免疫应答的一个重要指标。尽管以前对猪的抗体谱进行过一些研究， 但这些研究主要采用传统的克隆和Sanger 测序方法，而且主要研究未感染的胚胎或新生仔猪的天然抗体谱，而对于PEDV 这样重要的病毒感染或免疫后的抗体谱的研究未见报道。

近期 《Science China Life Sciences》 发表了哈尔滨兽医研究所猪消化道传染病创新团队的“Next-generation sequencing and single-cell RT-PCR reveal a distinct variable gene usage of porcine antibody repertoire following PEDV vaccination”的研究性论文。该论文结合抗体谱高通量测序和单个B 细胞PCR 扩增抗体技术，揭示了PEDV 免疫后猪外周血和肠系膜淋巴结组织中抗体基因的多样性和使用频率。研究人员分别从PEDV 免疫猪的外周血和肠系膜淋巴结中分离获取淋巴细胞，提取其RNA，采用5'RACE 技术制备抗体文库，然后进行高通量测序分析。结果显示，所有13 种猪抗体重链功能性可变基因、4 种所有的猪抗体K 链功能性可变基因以及5种所有的猪抗体L 链功能性可变基因均可以在外周血和肠系膜淋巴结中检测到；抗体重链可变基因主要使用IgHV1-4 和IgHV1S2，而K 链可变基因主要是IgKV1 基因家族，仅IgKV1-11 基因成员的使用频率就高达67.82 %，L 链可变基因主要使用IgLV3-3 和IgLV3-4。通过比较发现尽管外周血和肠系膜淋巴结中的抗体基因具有大体一致的多样性和使用频率，但存在局部的差异性，肠系膜淋巴结中抗体基因IgVH1-6 和Ig1-12 的使用频率要高于外周血。

此外，结合单个B 细胞PCR 扩增抗体技术，对PEDV S 蛋白特异性抗体基因的使用进行了统计分析。该研究进一步比较了总抗体谱和PEDV S 蛋白特异性的抗体谱。结果显示，与整体抗体谱相比较，PEDV S 蛋白选择性诱导IgHV1-4、IgHV1-14、IgLV3-3，展示出一个相对独特的PEDV S 蛋白的特异性抗体谱。该研究采用抗体高通量测序和单个B细胞PCR 扩增抗体技术对猪抗体谱的信息进行了补充和完善，不仅能够加深研究人员对PEDV B 细胞免疫应答的认识，而且该研究结果将对有效防控PED 和设计PEDV 新型疫苗提供重要指导。