丹参素衍生物ADTM对肝小静脉闭塞综合征作用研究

林依涵　叶倩茹　沈彦伶　泮艳璐　冯芝怡　陈磊

【摘 要】目的：通过建立土三七诱导小鼠肝小静脉闭塞综合征模型，探索丹参素衍生物ADTM对肝小静脉闭塞综合征的作用。方法：建立土三七提取液诱导小鼠肝小靜脉闭塞综合征模型，除对照组外，其余各组给予土三七浓缩提取液（15g/kg/d），同时给药组给予ADTM（60mg/kg/d），对照组给予同体积赋型剂，连续给药四周。采用生化法检测转氨酶和血脂，采用苏木素-伊红染色（HE）检测肝脏病理组织学改变。结果：与对照组比较，模型组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（AST）显著性升高，血清甘油三酯（TG）显著性降低，总胆固醇（CHO）无明显变化，肝组织肝窦充血严重，肝血窦间隙变小，肝血窦内皮细胞增生，kuffer细胞增生。给药组血清转氨酶没有降低，TG显著性升高，病理改变明显减轻。结论：土三七提取液可引起小鼠肝小静脉闭塞综合征，ADTM对土三七所诱导的肝小静脉闭塞综合征有明显的改善作用。

【关键词】土三七;吡咯烷生物碱;肝小静脉闭塞综合征;药物性肝损害

中图分类号： R284;R285文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）36-0264-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.36.125

肝小静脉闭塞征（Hepatic venular occlusive disease ， HVOD）是指由多种原因导致的非血栓性肝小静脉狭窄和闭塞，从而引起肝内窦后门静脉高压的肝血管性疾病[1]。据研究证明，引起该病的原因多由于摄入过多植物中的吡啶类生物碱。目前，已得到实验证实的含吡啶类生物碱植物有土三七、狗舌草、一点红等[2]。在以往的研究中，我们发现关于治疗肝小静脉闭塞综合征的药物十分有限，并且没有特效的治疗药物，目前临床上对于肝小静脉闭塞综合征的治疗主要以对症治疗为主[3]，多采用支持疗法，抗凝、祛聚疗法，促进肝细胞再生药物治疗法等。

已有文献报道，丹参对土三七所致肝小静脉闭塞综合征有明显的预防治疗作用，在丹参预防治疗组中，肝窦纤维化及中央静脉内膜纤维化较土三七模型组少，病变程度明显轻于模型组，没有明显的肝小静脉闭塞综合征表现[4]。由此可见，丹参对于治疗肝小静脉闭塞综合征具有一定的预防作用，且根据其实验中给药剂量的不同，也显示出不同的给药剂量对肝小静脉闭塞综合征的预防有不同程度的效果。

丹参素衍生物ADTM是由丹参素（DSS）与活性分子川芎嗪（TMP）结合得到的化合物。鉴于ADTM对于血管内皮细胞的作用显著，本实验尝试在动物水平上研究ADTM对土三七诱导的肝小静脉闭塞综合征的作用，一方面可为ADTM的临床应用提供依据，另一方面可为开发或者筛选治疗肝小静脉闭塞综合征的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

ICR小鼠84只，雄性，体重22～24g，SPF级，购自浙江省医学科学院，许可证号：SCXK（浙）2014-0001。小鼠饲养于恒温恒湿屏障动物房内。每日明暗时长各12小时，标准饲料，自由饮水。

1.2 主要试剂与仪器

土三七购自亳州市九康药业销售有限公司;丹参衍生物ADTM由暨南大学提供;甘油三酯、胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶测定试剂盒均购自北京北化康泰临床试剂有限公司;超声波清洗器（上海知信实验仪器技术有限公司）、生化分析仪（北京普朗有限公司）、离心机（长沙维尔康湘鹰离心机有限公司）、电子天平（奥豪斯仪器有限公司）。

1.3 土三七提取液制备和ADTM溶液配制

先取1000g土三七加水浸泡2h，将电磁炉调1300瓦进行加热煎煮，等到药液开始沸腾后降低功率至120瓦继续加热1.5h。用过滤器滤出药液，得到药液a，然后再次加3000ml的水用上述方法进行煎煮1.5h，滤出得到药液b，将滤液a和b混合，然后进行加热浓缩至500ml，最后放进冰箱冷藏备用。

1.4 动物分组与给药

动物适应一周后随机分为6组：正常对照组（10只）、土三七模型组（23只）、ADTM治疗组（22只），5只/笼饲养，每天更换水瓶，每2天更换1次垫料。ADTM治疗组每天灌胃ADTM溶液60mg/kg/d，1h后，再灌胃土三七提取液15g/kg/d;模型组每天灌胃同体积赋型剂60mg/kg/d，1h后，再灌胃土三七提取液15g/kg/d;正常对照组给予同体积赋型剂。

1.5 血样和肝组织处理

取血量需达到1ml以上，取血静置30min，置于离心机4℃/4500rpm/离心10min，吸取上层血清放入1.5ml EP管内，并存于冰箱冷冻。用手术剪取每只小鼠肝脏大叶同一部位三角状组织，放于含有10%中性福尔马林的试管中固定，留作病理检测。剩余的肝组织用生独立包装于-80℃冰箱储存。

1.6 生化法测定血清转氨酶和血脂

按照试剂盒说明书指示，利用生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的数值分析肝脏损伤情况，通过测定血清中甘油三酯（TG）和胆固醇（CHO）含量分析小鼠血脂的情况。

1.7 肝脏病理组织学检查

取肝组织经10%中性福尔马林溶液固定后做病理切片。酒精梯度脱水，常规石蜡包埋，连续切片（厚度约5μm），经HE染色后，光学显微镜下观察肝组织病理学改变。根据肝脏病变程度进行评分。

1.8 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件处理分析数据，采用SNK q检验对各组同一时间点的同一指标进行比较，实验数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 ADTM对肝小静脉闭塞综合征小鼠体重的影响

小鼠灌胃28天后，土三七模型组体重增加明显，毛发稀疏，食量明显减退，活动明显减少，腹腔肿大，剖腹后可见半透明腹水，试验期间小鼠死亡17只。各组小鼠实验前后体重都有明显增长。与正常组比较，模型组和给药组体重增长幅度较小。与模型组比较，给药组体重略大，体重个体差异较明显（表1）。

表1 各组实验小鼠实验前后体重分析

2.2 ADTM对肝小静脉闭塞综合征小鼠血清转氨酶水平的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT和AST均显著性升高，分别为正常对照组的2.5倍和1.3倍，而ADTM给药组小鼠血清转氨酶ALT和AST并没有显著性下降（表2）。

表2 ADTM对肝小静脉闭塞综合症小鼠血清转氨酶水平的影响

（注：n=10，mean±SD;###P<0.001vs.正常组）

2.3 ADTM对肝小静脉闭塞综合征小鼠血脂水平的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清TG明显降低，为对照组的63%，模型组血清CHO没有改变。ADTM给药组小鼠血清TG明显升高，CHO也没有改变（表3）。

表3 ADTM对肝小静脉闭塞综合症小鼠血脂水平

的影响

（注：n=10，mean±SD;###P<0.001vs.正常对照组;*P<0.05vs.土三七模型组）

2.4 ADTM对肝小静脉闭塞综合征小鼠肝组织病理学改变的影响

正常对照组小鼠肝小叶结構正常，肝细胞排列紧密，细胞绕中央静脉呈放射状排列，未见肝细胞脂肪变性、坏死。Kuffer细胞无明显增生，汇管区局部炎症细胞浸润。肝血窦正常，未见淤血、下狭窄或闭塞。未见明显纤维化，中央静脉未见狭窄;模型组小鼠肝小叶结构破坏，部分肝细胞核固缩，汇管区可见炎细胞堆积，部分汇管区纤维化，部分肝细胞脂肪变性，肝窦充血严重，肝血窦间隙变小，肝血窦内皮细胞增生，kuffer细胞增生。ADTM给药组小鼠肝病理改变比模型组明显减轻（表4、图1）。

表4 ADTM对肝小静脉闭塞综合症小鼠肝脏病理分析

（注：—：阴性;+：阳性，+的个数表示阳性的程度）

图1 ADTM对肝小静脉闭塞综合症小鼠肝脏

病理切片图

3 讨论

丹参是我国传统医学中应用最广泛的药物，其主要成分丹参素（DSS）是抗心脑缺血损伤的主要活性物质。为了提高丹参素的疗效，充分发挥其治疗特色，对丹参素进行了系统的化学结构修饰。经过大量的药效与药理学的研究，发现丹参素（DSS）与活性分子川芎嗪（TMP）结合得到的化合物ADTM对血管内皮细胞疗效显著。

本研究首先建立土三七诱导肝小静脉闭塞综合征模型，即连续灌胃土三七提取液15g/kg/d四周，模型组小鼠血清转氨酶ALT和AST水平显著性升高、血脂TG水平显著降低，而CHO无明显变化，肝小叶放射状排列结构破坏，肝细胞脂肪变性，肝窦充血严重，肝血窦间隙变小，部分狭窄、闭塞，肝血窦内皮细胞增生，kuffer细胞增生，汇管区可见纤维化。上述改变与以往研究一致[5]，均可反映出灌胃给药土三七提取液引起小鼠肝小静脉闭塞。丹参素衍生物ADTM（30mg/kg/d）给药对血清转氨酶ALT和AST升高并没有抑制，但可明显缓解TG的下降，并能明显减轻小鼠肝病理组织学改变，表明土三七提取液可引起小鼠肝小静脉闭塞综合征，ADTM对土三七所诱导的肝小静脉闭塞综合征有明显的改善作用。

已有的研究表明，在土三七已发现超过5种吡咯烷生物碱[6]，其中3种具有较强肝毒性：千里光宁、千里光非宁和全缘千里光碱，可有效致小鼠肝小静脉闭塞综合征。大量的实验研究表明川芎嗪、低分子肝素、激素等药物可有效地缓解小鼠肝小静脉闭塞综合征的症状[7-10]，可以确定这些药物对肝小静脉闭塞综合症有一定的疗效。通过本项目研究，土三七对肝小静脉闭塞综合征确实有诱导作用，可使小鼠血清转氨酶ALT和AST明显升高、血脂TG显著降低，ADTM对肝小静脉闭塞综合征有改善作用，但作用机制尚不明确，本实验可为丹参素衍生物ADTM的临床应用与开发提供实验数据。

【参考文献】

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