超声辅助醇提桑枝中1-脱氧野尻霉素

王中兴

【摘 要】1-脱氧野尻霉素（DNJ）是一种哌啶生物碱，具有降血糖、抗病毒等作用，在医疗保健方面具有重要的研究价值。以乙醇为溶剂，结合超声处理提取桑枝中的DNJ，研究料液比、乙醇浓度和超声时间对DNJ提取的影响，结果表明：桑枝中DNJ在料液比为1：20，乙醇浓度为65%，超声处理时间为35min时提取含量最高，达到0.253%。

【关键词】桑枝;1-脱氧野尻霉素;超声波;高效液相色谱

中图分类号： TQ461文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）35-0252-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.35.123

The Extraction of 1-Deoxynojirimycin by Ethanol Using Ultrasonic Assistant from Ramulus Mori

WANG Zhong-xing

（School of Modern Agriculture & Biotechnology，AnKang university， Ankang Shaanxi 725000， China）

【Abstract】1-Deoxynojirmycin （DNJ） which is known as hydroxyl alkaloid has hypoglycemic and antiviral effects， and has important research value in health care. The effect for DNJ extraction which includes solid-liquid ratio， ethanol concentration and ultrasonic time was studied.The results show that the DNJ extraction is the highest when liquid material ratio is 1：20， ethanol concentration is 65%， ultrasonic extraction time is 35min， and is up to 0.253%.

【Key words】1-deoxynojirimycin; Ultrasonic assisted extraction; High performance liquid chromatography

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一种极性化合物，分子式为C6H13NO4，分子量为163.7[1]，研究证实它对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用[2-3]，对血糖、甘油三酯、胆固醇等多项生理代谢指标具有良好的调节作用[4-6]，可以缓解肝脏的伤害[7-8]，降低胰岛素抵抗[9]，保护血管[10]，治疗肥胖症[11]，抗病毒，抑制肿瘤[12-14]，在医疗保健方面有着重大的应用价值。

DNJ的来源有动物、植物和微生物[15-17]，但目前植物是获取DNJ的主要来源，而已知的植物中，桑树中DNJ的含量最高。现有的研究中大多研究桑枝中DNJ的提取，但是相对桑枝，桑枝也是桑树占比很大的一部分，因此，研究桑枝中DNJ的提取，對于桑树的综合利用，蚕桑产业的发展具有重要意义。

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：桑枝采自恒2号桑树品种;

试剂：DNJ标准品（上海金穗生物制品有限公司）、芴甲氧羰酰氯（上海源叶生物科技有限公司）、乙腈和冰乙酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪1260Infinity（美国安捷伦公司），超声波清洗机KQ-250D（昆山市超声波仪器有限公司），高速万能粉碎机FW-100D（天津鑫博得仪器有限公司），烘箱DGX-9143 13-1（上海福玛实验设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品的准备

将桑枝用自来水清洗两次，再用蒸馏水清洗一次，在70℃的条件下烘干至恒重，粉碎保存。

1.3.2 超声辅助提取单因素实验

（1）料液比的影响。

准确称取5份桑枝粉各1g，分别放入5个50ml的烧杯中，依次加入浓度为55%的乙醇10ml、20ml、30ml、40ml和50ml进行浸泡，30min后放入超声波细胞破碎仪中进行超声处理，设置超声时间为10min，频率为50Hz，时间间隔为10s，完成后将溶液加入离心管中进行离心，条件为12000r/min，时长为15min，结束后收集上清液存储于冰箱中备用。

（2）乙醇浓度的影响。

准确称取5份桑枝粉各1g，分别放入5个50ml的烧杯中，依次加入20ml乙醇，浓度分别是55%、65%、75%、85%和95%，浸泡30min，放入超声波细胞破碎仪中进行超声处理，设置超声时间为10min，频率为50Hz，时间间隔为10s，完成后将溶液加入离心管中进行离心，条件为12000r/min，时长为15min，结束后收集上清液存储于冰箱中备用。

（3）超声时间的影响。

准确称取5份桑枝粉各1g，分别放入5个50ml的烧杯中，各加入浓度为55%的乙醇20ml，浸泡30min，放入超声波细胞破碎仪中进行处理，超声时间分别为10min、20min、30min、40min和50min，频率均为50Hz，时间间隔为10s，完成后将溶液加入离心管中进行离心，条件为12000r/min，时长为15min，结束后收集上清液存储于冰箱中备用。

1.3.3 超聲辅助提取正交实验

根据单因素实验结果，选取料液比、乙醇浓度和提取时间各因素合适的水平，进行正交实验。

1.4 DNJ含量的检测

所采样品均采用反相高效液相色潽—紫外检测法测定[18]，每个样品重复测定2次，取平均值。

2 结果分析

2.1 标准曲线的绘制

根据验方法对DNJ系列标准溶液进行测定，线性回归方程y=10255x+133.16，相关系数为0.9903。

图1 DNJ标准曲线

2.2 标准液的检测图

图2 标准品色谱图

2.3 样品检测图

图3 样品色谱图

2.4 不同料液比的影响

根据图4可得，在桑枝粉与乙醇比例为1g：20ml的时候，DNJ的提取量最高。

图4 不同料液比对DNJ提取的影响

2.5 不同乙醇浓度的影响

图5 不同乙醇浓度对DNJ提取的影响

根据图5可得，在乙醇浓度为65%的时候，野尻霉素的提取量最高。

2.6 不同超声时间的影响

图6 不同超声时间下DNJ含量柱形图

根据图6可得，在超声时间为30min的时候，野尻霉素的提取量最高。

2.7 正交分析

根据单因素试验的结果，进行正交实验设计。

表1 正交因素水平表

表2 直观分析表

表3 方差分析表

从表2、表3可以看出，各因素对DNJ提取量的影响为：乙醇浓度>料液比=超声时间。DNJ提取最适条件为A2B2C3，即65%乙醇、料液比1：20、超声波处理35min。

2.8 验证实验

以正交实验得到的DNJ最优提取条件进行验证试验，得到DNJ的提取量为0.253%，高于正交实验中其他组的结果，证实得到的最优结果是有效的。

3 结论

根据实验结果分析可得，用65%的乙醇作为提取剂，桑枝粉与乙醇按1：20，在超声波细胞破碎仪中处理35min，所提取的野尻霉素含量最高，达到0.253%。

【参考文献】

[1]冉艳萍，廖森泰，刘吉平.1-脱氧野尻霉素（DNJ）的研究进展[J].广东蚕业，2012（03）：44-48.

[2]Saunier B， Kilker R J， Tkacz J S， et al. Inhibition of N-linked complex oligosaccharide formation by 1-deoxynojirimycin， an inhibitor of processing glucosidases[J].J Biol Chem，1982，257（23）：14155-14161.

[3]Li Y G， Ji D F， Zhong S， et al. 1-deoxynojirimycin inhibits glucose absorption and accelerates glucose metabolism in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Sci Rep，2013，3：1377.

[4]Hu X Q， Thakur K， Chen G H， et al. Metabolic Effect of 1-Deoxynojirimycin from Mulberry Leaves on db/db Diabetic Mice Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Based Metabolomics[J].J Agric Food Chem，2017.

[5]Sevsek A， Celan M， Erjavec B， et al. Bicyclic isoureas derived from 1-deoxynojirimycin are potent inhibitors of beta-glucocerebrosidase[J].Org Biomol Chem，2016，14（37）：8670-8673.

[6]Kwon H J， Chung J Y， Kim J Y， et al. Comparison of 1-deoxynojirimycin and aqueous mulberry leaf extract with emphasis  on postprandial hypoglycemic effects： in vivo and in vitro studies[J].J Agric Food Chem，2011，59（7）：3014-3019.

[7]Liu Q， Li X， Li C， et al. 1-Deoxynojirimycin Alleviates Liver Injury and Improves Hepatic Glucose Metabolism in db/db Mice[J].Molecules，2016，21（3）：279.

[8]Do H J， Chung J H， Hwang J W， et al. 1-deoxynojirimycin isolated from Bacillus subtilis improves hepatic lipid metabolism and mitochondrial function in high-fat-fed mice[J].Food Chem Toxicol，2015，75：1-7.

[9]Liu Q， Li X， Li C， et al. 1-Deoxynojirimycin Alleviates Insulin Resistance via Activation of Insulin Signaling PI3K/AKT Pathway in Skeletal Muscle of db/db Mice[J].Molecules， 2015，20（12）：21700-21714.

[10]E S， Kijima R， Honma T， et al. 1-Deoxynojirimycin attenuates high glucose-accelerated senescence in human umbilical vein endothelial cells[J].Exp Gerontol，2014，55：63-69.

[11]Tsuduki T， Kikuchi I， Kimura T， et al. Intake of mulberry 1-deoxynojirimycin prevents diet-induced obesity through increases in adiponectin in mice[J].Food Chem， 2013，139（1-4）：16-23.

[12]Liu M， Wang S， Zhou Y D， et al. An iminosugar N-pentafluorobenzyl-1-deoxynojirimycin as a novel potential immunosuppressant for the treatment of Th2-related diseases[J].Bioorg Med Chem Lett，2012，22（1）：564-570.

[13]彭忠田，申璀，譚德明，等.脱氧野尻霉素衍生物抗乙型肝炎病毒的体外试验研究[J].中国药房，2007（01）：22-24.

[14]娄德帅，范涛，王储炎，等.全蚕粉中1-脱氧野尻霉素的提取分离及分离物对肿瘤细胞的抑制作用[J].蚕业科学，2010（01）：109-114.

[15]孙凌云，孙波，赵春晓，等.26种昆虫体内的1-脱氧野尻霉素含量测定[J].蚕业科学，2010（03）：558-563.

[16]朱运平，李秀婷，李里特.Bacillus subtilis B2产1-脱氧野尻霉素（DNJ）发酵条件优化[J].食品科学，2010（17）：290-293.

[17]沈以红，朱见，代方银，等.野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定[J].蚕业科学，2007（04）：674-677.

[18]施新琴，崔为正，裘立群，等.用反相高效液相色谱-紫外检测法测定1-脱氧野尻霉素的含量[J].蚕业科学，2006（01）：146-149.