葡萄糖氧化酶的应用及其在饲料中的作用机理

王佰涛，王一雯，许 杰，马 焕，2，陈国参，刘德海，2

（1.河南省科学院生物研究所，河南郑州450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南郑州450008）

葡萄糖氧化酶（GOD）（EC1.1.3.4）是一种具有良好特性的需氧脱氢酶，能够催化β-D-葡萄糖脱氢氧化生成葡萄糖内酯和过氧化氢，葡萄糖内酯会转化为葡萄糖酸。目前葡萄糖氧化酶已经广泛应用于饲料业和食品业的各个领域，其在化学、医药、纺织和其他生物技术领域中也有一些新颖的应用（Bankar等，2009）。

1 葡萄糖氧化酶的性质

葡萄糖氧化酶广泛存在于自然界当中，其中微生物来源占绝大部分，主要是青霉和黑曲霉（Eremin等，2004）。高纯度葡萄糖氧化酶为近白色或淡黄色粉末，易溶于水，几乎不溶于有机溶剂。不同来源的葡萄糖氧化酶分子量也有所不同，一般为130～180 kDa。葡萄糖氧化酶对底物有较高的特异性，对β-D-葡萄糖的催化活性要远远大于α-D-葡萄糖，且底物中任一细微的结构改变都可能影响到催化活性。如果就酶促反应速率而言，以β-D-葡萄糖为底物的氧化速率作参考（100%），使用黑曲霉葡萄糖氧化酶时，只有2-脱氧-D-葡萄糖、4-O-甲基-D-葡萄糖、6-脱氧-D-葡萄糖的氧化速率能够保持在较好的速率范围内（10%～30%），当使用其他底物参与反应时，反应速率还不到β-D-葡萄糖氧化速率的2%（Leskovac等，2005）。

大多数酶的活性与活性位点中氨基酸的电离状态息息相关，因此其所处的pH环境对活性影响很大。葡萄糖氧化酶的最佳pH为3～7，在pH高于7或者低于3时活性较低 （Sumaiyas等，2015）。大多数真菌或酵母菌来源的葡萄糖氧化酶在酸性至中性范围内有最佳活性，例如黑曲霉和产黄青霉的最适pH为5～6（Kalisz等，1991）。但也存在少数真菌来源的葡萄糖氧化酶在偏碱性范围内活性较好，例如绳状青霉和变灰青霉葡萄糖氧化酶最适pH为6～8（Sukhacheva等，2004）。葡萄糖氧化酶在30～60℃活性较好，50℃左右活性最优，在温度高于60℃或者低于30℃时活性较低。例如尼崎青霉葡萄糖氧化酶在40～60℃活性较好（Kalisz等，1991）。葡萄糖氧化酶还存在一些活性抑制剂如Ag+、Hg2+、Cu2+、羟胺、肼、苯肼、二甲酮和硫酸氢钠等，这些金属离子和化学物质的存在会抑制其活性（Nakamura等，1968）。孙丹等（2016）研究了银离子诱导葡萄糖氧化酶结构的变化发现，银离子会与葡萄糖氧化酶的辅基FAD结合进而影响其活性。

2 葡萄糖氧化酶的结构及催化机制

从结构上来说，葡萄糖氧化酶是一种含有黄素的糖蛋白，由两个相同的80 kDa亚基组成，每个亚基含有一个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基，因而亦可称为黄素蛋白或黄酶。每个葡萄糖氧化酶亚基都含有一个由四个α-螺旋支撑一个反平行的β折叠用来与底物结合。FAD辅基在葡萄糖氧化酶催化过程中充当氧化还原的电子载体，在反应中被还原为FADH2。研究发现大部分从微生物中得到的葡萄糖氧化酶含有约11%～13%甘露糖型的碳水化合物，其中绝大部分都是以氮苷和氧苷形式与酶的蛋白主链相连接（Nakamara等，1968）。

对葡萄糖氧化酶的三级结构研究表明，其活性部位由位于疏水口袋底部的FAD构成，此结构可与葡萄糖相结合，催化反应的中心是FAD异四氮嗪环的N-5位。酶的活性位点除了FAD外，还有三种与催化密切相关的氨基酸侧链：His 516（pKa=6.9）、Glu 412（pKa=3.4）、His 559（pKa＞8）。Glu 412部分埋藏在蛋白质分子中，与His 559通过氢键连接，而His 516的侧链更加灵活，更容易暴露在外，并且这些氨基酸残基与葡萄糖氧化酶的反应速率密切相关（Leskovac等，2005）。

从催化机制上来说，葡萄糖氧化酶的催化反应不仅需要糖分子作为还原剂和电子供体，还需要氧化剂和电子受体共同完成催化反应。该反应可分为一个还原半反应和一个氧化半反应。在还原半反应中，首先葡萄糖与酶的结合会引起水分子从活性部位排出，葡萄糖C-1位置羟基的质子转移至酶的碱性侧链上（His 516），即后者发生质子化，葡萄糖被氧化为葡萄糖内酯，然后将C-1位置氢转移至FAD异四氮嗪环的N-5位置，生成质子化的His 516和FADH2（Witt等，2000）。在氧化半反应中，第一步是氧气扩散进入活性中心与FADH2发生接触，接着还原型辅基FADH2被氧分子氧化为FAD，氧分子被还原为过氧化氢。这个反应是通过两个单电子转移完成，反应的中间产物是超氧阴离子自由基和黄素半醌自由基（Leskovac等，2005）。还原半反应和氧化半反应共同组成葡萄糖氧化酶的氧化还原体系。

3 葡萄糖氧化酶的应用

3.1 饲料 微生物饲料酶制剂作为一种饲料添加剂，能够提高动物对饲料的消化利用，改善动物的代谢机能，近年来在饲料中应用广泛。其中葡萄糖氧化酶于1999年7月26日被中华人民共和国农业部第105号文正式批准列入《允许使用的饲料添加剂品种目录》，目前主要应用在家禽和家畜配合饲料中。

3.1.1 在家禽配合饲料中的应用 在家禽配合饲料中添加葡萄糖氧化酶可以提高家禽的产蛋性能，减少抗生素的使用量，降解饲料中的霉菌毒素，促进动物的生长。赵国先等（2007）研究表明，与对照组相比，试验组饲料中添加0.1%～0.4%葡萄糖氧化酶后产蛋率得到提高，破软蛋率有所下降，并且饲料中添加0.4%葡萄糖氧化酶能够显著增加白蛋白和血清总蛋白含量。汤海鸥等（2016）研究在饲料中添加不同剂量的葡萄糖氧化酶对肉鸡生长性能的影响及替代抗生素的效果。结果表明，与对照组相比，试验组肉鸡全期日增重显著提高，料肉比显著下降；与添加正常量抗生素的对照组相比，添加酶制剂的试验组肉鸡的各项生长指标无显著差异，说明用葡萄糖氧化酶替代抗生素来提高动物机体的免疫力效果显著。并且研究发现葡萄糖氧化酶可以改善家禽肉质，降解饲料中的霉菌毒素和霉变饲料对动物的伤害。孙春阳等（2014）研究葡萄糖氧化酶和酵母硒复合添加剂对白羽鸡抗氧化性能及肉质的影响，结果表明添加二者复合剂可以提高白羽鸡抗氧化能力，改善鸡肉肉质。汤海鸥等（2015）在肉鸭饲料中添加葡萄糖氧化酶探究其解除黄曲霉毒素B1的效果，结果发现葡萄糖氧化酶制剂能够改善攻毒肉鸭的生长性能，降低攻毒肉鸭死亡率，说明葡萄糖氧化酶具有解除霉菌毒素的能力。

3.1.2 在家畜配合饲料中的应用 在家畜配合饲料中添加葡萄糖氧化酶可以提高对饲料的吸收利用率，促进家畜的生长。杨久仙等（2011）研究表明，在饲料中添加葡萄糖氧化酶能够加强仔猪肠道酸性环境，改善肠道表面结构，提高对饲料的消化吸收率和利用率，促进仔猪的生长与发育。林谦等（2015）研究不同水平葡萄糖氧化酶替代氧化锌对仔猪抗泻的作用效果发现，与氧化锌组相比，仔猪不仅腹泻率降低，平均日增重也有所提高，总体效果强于氧化锌。一头母猪每年能够生产的断奶仔猪重量和断奶仔猪数量是评价其生产性能的重要指标，研究证明葡萄糖氧化酶在提高母猪生产性能方面效果显著。尤瑞祺等（2017）研究表明，在母猪妊娠后期的饲料中添加适当剂量的葡萄糖氧化酶可以提高母猪的生产性能及母猪和仔猪的抗氧化能力。葡萄糖氧化酶在促进家畜产后恢复和促进泌乳方面也卓有成效，刘亚娟等（2016）研究表明，饲料中添加0.4%的葡萄糖氧化酶可以显著提高母兔泌乳性能，促进母兔产后体况的恢复。

3.2 食品 葡萄糖氧化酶可以在食品中作为液体或者粉末添加剂使用，并且常常被归类为抗氧化剂或者防腐剂。在生鲜食品业，生鲜食品的新鲜程度主要取决于空气中氧气的影响。因此，除氧是保存生鲜食品的重要途径，而目前市场上存在的一些化学性抗氧化剂会对人体的健康产生不利影响。葡萄糖氧化酶作为一种绿色健康的食品添加剂，能够专一地消耗氧气，阻止生鲜食品发生变质或者氧化，延长食品的保鲜期。例如苹果汁当中含有许多酚类物质，在空气中极易氧化加深为褐色，将葡萄糖氧化酶按0.4%添加量加入到苹果汁中，可起到保鲜作用（王磊等，2018）。另外通过研究发现，葡萄糖氧化酶对海鲜食品及茶叶等的保鲜效果也十分显著（徐德峰等，2017），能够很好地保持食品的口感风味。当葡萄糖氧化酶用作食品包装中的防腐剂时，如果发生包装破裂或空气泄漏，葡萄糖氧化酶和氧气反应将葡萄糖转化为葡萄糖酸，导致pH下降，这样可以根据包装中pH条带的变化来判断包装是否完整。某些特殊的包装也允许少量空气泄露，其原理是通过葡萄糖氧化酶产生少量的过氧化氢来抑制微生物的生长。

在面制品加工业中，加工面条过程中添加葡萄糖氧化酶制剂，可以显著改善面团的强度和弹性，有效地提高面条的嚼劲，增加耐煮性（封雯瑞等，2000）。此外葡萄糖氧化酶对馒头芯的硬度具有显著地改善效果（林金剑等，2011）。作用原理是其反应过程产生的过氧化氢可以将面筋蛋白分子的巯基转化为二硫键，增加了强度，提高面制品弹性（夏萍等，1999）。但如果葡萄糖氧化酶产生过多的过氧化氢就会对其催化活性产生抑制，因此食品级葡萄糖氧化酶制剂中通常会加入过氧化氢酶，以防止过氧化氢积累过多对葡萄糖氧化酶的活性产生影响（Bao等，2003）。

3.3 葡萄糖酸生产 葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖之后会产生葡萄糖酸，而葡萄糖酸及其衍生盐在实际生产中应用十分广泛，例如食品、纺织印染、金属表面清洁、凝结剂、化妆品、药品等，如作为食品添加剂，其可以用作食品中的酸度调节剂、膨松剂、抗氧化剂、螯合剂等（Brookes等，2005）。在工业上葡萄糖酸由发酵获得，每年产量在五万吨至十万吨（Singh等，2005），但通过发酵过程来生产葡萄糖酸，时间长，投入大，并且发酵完成后分离程序复杂，生产成本太高。Lantero等（2001）用生物酶转化法生产葡萄糖酸，发现转化率已经能够达到较高水平，不仅节约了发酵时间，也省去了复杂的分离除杂过程。尽管具有这些潜在的优势，目前工业应用酶转化法生产葡萄糖酸还比较少，说明在大规模应用之前还有许多困难要克服。

3.4 葡萄糖氧化酶传感器 目前市场上存在的生物传感器中，大多数是葡萄糖氧化酶生物传感器，并且其主要基于固定化葡萄糖氧化酶。目前葡萄糖氧化酶传感器可以应用在金属离子、葡萄糖的浓度监测及医学方面。例如汞离子在酸性环境通过与葡萄糖氧化酶的某些活性位点结合能够抑制其活性，据此汤琳等（2005）通过聚苯胺膜制作葡萄糖氧化酶电极，然后用戊二醛交联固定葡萄糖氧化酶，能够完成酸性环境中对汞离子的含量测定，且不受其他重金属离子的影响。张彦等（2009）通过应用壳聚糖包埋法将葡萄糖氧化酶固定到鸡蛋膜上，制成葡萄糖氧化酶生物传感器。此传感器根据葡萄糖氧化酶消耗的葡萄糖和氧气的正比关系，运用氧电极能够将氧气含量变化转化为电信号，据此测定葡萄糖含量。在医药领域，通过刺破手指采血可以应用葡萄糖氧化酶传感器检测血糖浓度，但这种方法存在有创口、不能连续监测等缺点。目前开发的荧光式葡萄糖氧化酶传感器能够被应用于体内血糖浓度的连续监测，其原理是葡萄糖氧化酶辅基FAD氧化状态的变化会影响葡萄糖氧化酶的荧光强度，然后通过监测葡萄糖氧化酶荧光强度的变化来监测血糖浓度（Brown等，2006）。与传统的刺破手指采血相比，其具有能够实现连续监测血糖浓度、无创口、反应灵敏等优势。另外，在癌症诊断方面，葡萄糖氧化酶传感器能够用于对某些肿瘤标志物的检测，并且一些对应的癌症治疗策略也被开发出来（Fu等，2018）。

3.5 其他行业 目前葡萄糖氧化酶并不局限于上述应用。例如在纺织业中采用葡萄糖氧化酶环保型生物漂白工艺代替化学漂白具有良好的前景（王石磊等，2010）。化学漂白要求在碱性条件，且所需温度也较高，而葡萄糖氧化酶生物漂白则可以在低温中性条件下进行。这意味着这种处理方法能够在能源和污水处理方面节省大量费用。在生物燃料电池方面，葡萄糖氧化酶用作催化剂的燃料电池是一种环保电池，能量转化率较高，但目前技术并不成熟，需要对其进一步开发（吕丰等，2006）。

4 葡萄糖氧化酶在饲料中的作用机理

4.1 调节肠道微生物平衡，提高肠道消化能力葡萄糖氧化酶消耗葡萄糖生成的葡萄糖酸呈酸性，可以降低肠道的pH，抑制有害菌群生长，促进有益菌群生长，并且葡萄糖酸能够促进肠道中的食糜产生小分子有机物，为肠道有益菌的生长提供能量（Tsukahara等，2002），进而调节肠道微生物平衡。生成的过氧化氢具有广谱的杀菌作用，研究表明其可以抑制大肠杆菌和沙门氏菌生长（Bankar等，2009），但这种抑菌能力和抗生素的作用机理不同，不会产生耐药性，因此将其应用在畜牧业中属于绿色养殖的发展方向。消化道pH的降低有利于消化酶原的激活，能够促进动物产生促胰液素，提高胰酶水平，提高消化道的消化活性（冷向军等，2002）。宋海彬等（2010A）研究表明，在饲料中添加葡萄糖氧化酶能够提高肉鸡肠道绒毛高度，降低肠道隐窝深度，改善肠道胰蛋白酶和淀粉酶的活性，提高肠道消化能力。

4.2 提高抗氧化能力 自由基存在于动物机体之内，如果积累过多会造成机体在分子及细胞水平的损伤，进而诱发各种疾病，葡萄糖氧化酶可以消耗氧气产生过氧化氢，过氧化氢能够刺激有益菌群产生过氧化氢酶，后者可以消除机体内的自由基，保护肠道上皮细胞，减少肠道损伤（胡常英等，2014）。血清中脂质过氧化物丙二醛的含量能够反映机体清除自由基的能力，研究发现葡萄糖氧化酶能够升高血清中超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛水平，提高动物机体的抗氧化能力。此外自由基的产生会影响精卵结合，影响动物的生产性能，清除自由基还可以提高动物的生产能力（尤瑞祺等，2017）。

4.3 改善生化指标 甲状腺激素和生长激素能够促进动物的代谢，增强蛋白质的合成，与动物的生长速度息息相关。研究发现葡萄糖氧化酶可以提高血清中有关激素如生长激素、碘甲状腺原氨酸及甲状腺素的含量，因此在饲料中添加葡萄糖氧化酶可以促进动物的生长（汤海鸥等，2015）。此外，肌酸激酶是存在于肌细胞中的一种特异性酶，血液肌酸激酶水平升高会增加家禽心肌、骨骼肌、脑组织病变的风险，而研究发现葡萄糖氧化酶能够降低细胞膜通透性，抑制肌酸激酶从肌细胞进入血液，从而降低动物发生疾病的风险（赵国先等，2007）。

4.4 提高免疫力 研究发现葡萄糖氧化酶可以提高动物的免疫力（Wang等，2018），提高免疫球蛋白IgA水平（宋海彬等，2010B），减少抗生素的使用。例如在母猪妊娠后期，由于胎儿快速生长容易在体内累积大量自由基，产生炎性因子，会降低免疫球蛋白水平，从而降低动物机体的免疫力，通过在饲料中添加葡萄糖氧化酶能够减少免疫力低下胎儿的出现。此外，在饲料中添加葡萄糖氧化酶之后，肠道中的有益菌群增多可以提高动物机体的特异性和非特异性免疫，进而提升机体的免疫防御能力（刘辉等，2010）。

5 结语与展望

葡萄糖氧化酶作为一种绿色环保的酶制剂，对机体无毒害作用，在饲料中应用能够改善动物生长性能，提高畜牧业产值，在食品中应用可以改善口感，延长保鲜时间，并且在生物燃料电池等新兴产业中也具有广泛的应用前景。但目前葡萄糖氧化酶的产量和质量仍然有待提升，下一步希望通过基因工程技术能够不断提高酶的活力和表达量，其潜在利用价值仍有待进一步开发。