NLRP3炎症小体与糖尿病性心肌病研究进展

李雪莲，李智洋，李宾公，赖性君

(1. 南昌大学第一附属医院心内科，江西 南昌 330006；2. 南京医科大学，江苏 南京 211166)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)作为糖尿病患者死亡的主要原因之一，受到国内外学者的广泛关注。DCM的主要病理特点是心肌结构和功能的障碍，包括心肌细胞凋亡、心肌纤维化、左室功能障碍和代谢紊乱等。有研究发现[1]，心肌中的炎症反应可能在促进DCM发生、发展中起到重要作用，特别是在心肌细胞中大量表达的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)被发现与心肌细胞的死亡有密切的联系。在病理因素的刺激下，多种途径和通路激活心肌细胞中NLRP3炎症小体的活化，进而激活下游炎症因子，爆发级联式炎症反应，最终导致心肌细胞损伤。因此，了解NLRP3炎症小体的活化过程至关重要，一方面，对DCM的发病机制可有进一步的认识；另一方面，可为药物治疗DCM提供靶点。本文收集近年来国内外文献研究进展，对NLRP3的活化机制，以及其与DCM发病之间的联系进行阐述。

1 NLRP3炎症体的构成

炎症体在机体的固有免疫反应中扮演重要角色，是由胞质内模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)参与构成的多蛋白复合物[2]。在细胞受到外界信号刺激时，位于胞质的炎症体PRRs识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或损伤相关分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，然后发生结合，从而激活下游的级联信号。NLRP3炎性体的组成包括凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、NLRP3及caspase-1前体3部分[3]。在外界信号刺激下，NLRP3蛋白通过其N端的热蛋白结构域，与接头蛋白ASC的热蛋白结构域结合，募集pro-caspase-1，从而激活caspase-1。激活后的caspase-1介导白细胞介素-1β前体(pro-IL-1β)和白介素细胞18前体(pro-IL-18)切割活化成IL-1β和IL-18，释放到细胞外，促使组织细胞的炎症坏死(pyroptosis)[4-5]。

2 炎症小体的活化与调控

NLRP3的激活可以由多种微生物产物，如二氧化硅、尿酸盐、病原体、细胞中的ATP、β淀粉样蛋白等引发。目前，对于NLRP3炎症小体的活化途径虽然存在争议，大多数认为有3种机制。第一种机制：细胞接受刺激使得相应离子通道开放，促进钾离子外流，介导NLRP3炎症小体活化。第二种机制：胞外的大颗粒物质被摄入胞内，加重溶酶体负担，使其破裂，大量破裂的溶酶体内容物释放出来，直接刺激炎症体的活化。第三种机制：PAMPs或DAMPs的侵入，促进胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生增多，并通过相应的通路促进炎症小体的聚集及激活[6]。借由以上3种途径，使游离的NLRP3变成具有生物学活性的物质，进而发挥其生物学活性。除上述途径外，人体内还存在多种抑制NLRP3炎症体过度活化的机制，如生理状态下的自我调控，凋亡相关蛋白Bcl-2、COP蛋白、POP蛋白对炎症小体活化的负性调控。还有研究发现，自噬在多个环节参与调控炎症小体的活化过程。

3 DCM的发病机制

DCM的发病机制尚未阐明，但研究发现，氧化应激、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、线粒体损伤、钙离子调节失衡、心脏自主神经病变及微小RNA(microRNA，miRNA)改变等，均可能参与DCM的发生、发展[1,7]。近年来有大量研究证实，心肌持续慢性炎症状态可能与心肌肥大、纤维化以及心功能不全有关[8]，促进DCM的发生、发展。其中，对NLRP3炎症小体的研究获得了进展。研究证实，NLRP3炎性小体在抑郁症、动脉粥样硬化、心肌缺血/再灌注等多种疾病发病中扮演重要角色[9]。Zhang等[10]发现，NLRP3炎症体抑制小鼠心肌成纤维细胞cAMP的表达，从而减弱心肌收缩力。而且炎症反应通过激活NLRP3-ASC-caspase-1轴，诱导和分泌炎症细胞因子IL-1β和IL-18等，推动了DCM的病程。NLRP3炎症体活化在生理情况下具有感知代谢紊乱、启动稳态调节程序的积极作用。如募集吞噬细胞、清除病原体；促胰腺β细胞增生、促进胰岛素分泌释放，使得血糖水平达到稳定状态；维持三酰甘油等脂质代谢平衡；促进肠道微生态达到稳定，以及诱导Th2细胞分化等。当外界信号持续刺激细胞时，诱发一系列级联反应，使NLRP3炎症小体大量活化，从而引发过度炎症反应。研究证实，高血糖能作为刺激信号，有效地诱导NLRP3的装配及活化[11]，在DCM的高糖损伤及炎症损伤中起重要作用[9]。除此之外，在糖尿病模型中，饱和脂肪酸、修饰的低密度脂蛋白、神经酰胺等，都可以促进NLRP3的活化，导致更严重的器官损伤和并发症[12]。无论是在心肌细胞中，还是在浸润的炎症细胞中，NLRP3均参与了心肌病的发生和发展。在II型糖尿病模型鼠的心肌细胞中，可观察到NLRP3炎症小体被激活[1]，心肌纤维排列紊乱和心功能下降。在DCM大鼠心肌中可见NLRP3、caspase-1明显表达，当敲除大鼠NLRP3或应用caspase-1抑制剂时，大鼠心肌纤维化减少，心功能明显改善[13]。一磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是调控生物能量恒定的重要传感分子，被认为是糖尿病及其心脏并发症的重要靶点。AMPK激活后，通过激活上游激酶LKB1、CaMKKβ、Tak1等，实现降低高血糖和高血脂、减轻氧化应激水平和炎症反应、抑制蛋白质合成等目标，从而阻止DCM的病程进展。AMPK能够调控线粒体代谢，减少氧化应激水平，还能减少NF-κB的活化，以控制NLRP3炎症小体活化介导的炎症反应[14]。在DCM大鼠心脏组织和心肌细胞可以观察到肌纤维走形紊乱，有溶解现象，有肿胀和空泡化的线粒体等细胞焦亡(pyroptosis)现象[13]。细胞焦亡是近年来广受关注的细胞程序性死亡方式。细胞焦亡的发生机制与研究较多的细胞凋亡等形式不同，其特征是由NLRP3炎性体活化引起的caspase-1依赖性的细胞炎性死亡，表现为胞膜破裂，炎症物质及胞外物质从孔隙释放到细胞间质，导致细胞器及细胞质开始肿胀，直到细胞破裂死亡，随着细胞死亡，内容物释放到胞外，引起胞外炎症因子的大量激活，激发更加严重的炎症反应，造成严重的组织损伤。细胞焦亡现象的发现，证实了NLRP3炎症小体对DCM的发病起了重要推动作用。

4 NLRP3参与DCM的发病机制

4.1 线粒体-ROS-NLRP3炎性小体线粒体是糖、脂肪、蛋白质三大物质代谢中心，为心肌细胞提供能量，线粒体功能障碍在糖尿病病理过程中起重要作用。线粒体的融合紊乱和分裂、能量代谢异常、ROS产生增加、心磷脂变化以及钙紊乱等都促进了DCM的发展。研究发现，线粒体功能障碍与NLRP3炎症体激活密切相关，正常生理情况下，ROS在线粒体内生成较少；高糖等外界刺激使ROS急剧增加，机体抗氧化的能力相对不足，引起大量ROS的集聚，受损线粒体释放出的线粒体DNA(mtDNA)和线粒体ROS(mtROS)，二者作为DAMP信号分子刺激NLRP3的活化[15]。高糖作用下的心肌细胞线粒体ROS释放增多，NLRP3炎性体活化，用Mito-TEMPO或N-乙酰半胱氨酸抑制线粒体ROS释放后，使得心肌细胞NLRP3活化、IL-1β释放受到抑制[16]。上述研究结果证实高糖刺激损伤线粒体，产生大量ROS是DCM中NLRP3炎症小体活化的重要信号。

4.2 硫氧还原蛋白结合蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)-NLRP3炎性小体未接受刺激时，TXNIP与氧化还原酶硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)结合，活性受到抑制；细胞受到外界信号刺激，线粒体ROS释放增加时,该复合物解离, TXNIP与NLRP3(主要是LRRs结构域)结合，进而激活NLRP3炎性体，最终导致细胞因子的分泌增加[17]。有研究发现，糖尿病鼠心脏组织中TXNIP、NLRP3炎性小体及IL-1β蛋白的表达较正常鼠升高[6]。沉默糖尿病大鼠心肌细胞TXNIP的表达，可以抑制NLRP3的活化，缓解高糖导致的细胞损伤[18]。在DCM进程中，TXNIP可能作为高糖刺激与NLRP3炎性体活化之间的连接信号。

4.3 ROS-NF-κB-NLRP3炎性小体通路NF-κB是炎症反应的重要调节因子。NF-κB诱导促炎细胞因子，如TNF-α、IL-6、pro-IL-1β和pro-IL-18在心脏组织的表达。心肌细胞在高糖刺激下可以诱导NF-κB的活化。在相应刺激下，释放的ROS能诱使NF-κB发生磷酸化，进入细胞核内的磷酸化NF-κB能调节NLRP3的编码基因，使NLRP3 mRNA表达增加。而且磷酸化的NF-κB还可以调控NLRP3的转录后水平，增加其蛋白的表达，为NLRP3炎性小体活化提供物质基础[19]。研究发现，在DCM模型中，NF-κB磷酸化水平上升，NLRP3炎症小体大量活化。而在使用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸后，NF-κB磷酸化水平明显下降，NLRP3的mRNA、蛋白水平表达相应降低，NLRP3炎症小体活性也降低[13]。并且给予糖尿病大鼠腹腔注射NF-κB抑制剂，可以直接下调NLRP3炎性小体的表达及活化[19]，缓解2型糖尿病引起的心脏炎症、纤维化，并改善心脏功能。

4.4 自噬NLRP3炎性小体通路自噬是真核生物清除损伤蛋白质、细胞器或胞内病原体，来维持细胞内稳态，实现细胞器再利用的降解过程。自噬分为非选择性的巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬等。有研究证实，LC3或Beclin-1敲除鼠的骨髓巨噬细胞内mtROS增多，NLRP3炎症小体大量活化、caspase-1、IL-1β表达增加[20]。使用PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤(3MA)抑制自噬，可增加mtROS的产生，并激活NLRP3-caspase-1-IL-1β轴[21]。以上结果表明，自噬通过抑制细胞内ROS产生，从而负性调节炎症小体激活。线粒体自噬是细胞自噬的一种持殊形式，它主要通过自噬小体来清除功能异常的线粒体来发挥作用。心肌细胞富含线粒体，线粒体是细胞ROS的主要来源。高糖刺激下导致线粒体受损，当细胞自噬水平正常时，受损的线粒体能被及时吞噬，不引起接下来的一系列炎症激活反应，防止心肌损伤。但是有研究发现，Ⅰ型糖尿病小鼠的心脏自噬水平受到抑制[22]，受损线粒体不能及时清除，从而释放大量的ROS，促使NLRP3炎症小体装配和活化，加之活化的炎性体缺乏自噬体的吞噬，大量活化的NLRP3炎性体激活下游炎症反应，加剧了心肌损伤。

5 NLRP3炎症小体的药物调控

如上所述，NLRP3炎症小体过度激活诱发的炎症反应参与了DCM的发生、发展，可能成为DCM新的药物治疗靶点。瑞舒伐他汀被证实在DCM模型中，通过抑制TXNIP，减少NLRP3 mRNA的表达，抑制了NLRP3炎性体活化[13]。绞股蓝总皂苷在高糖环境下，可以抑制H9c2细胞线粒体细胞色素C的释放，改善线粒体损伤，从而抑制NLRP3炎症小体活化，改善心肌损伤[16]。丹酪酸B能提高线粒体自噬蛋白SIRT1、Parkin，促进H9c2细胞线粒体自噬水平，受损线粒体得以吞噬，ROS含量下降，NLRP3活化减少[23]。由于AMPK在控制新陈代谢中的重要作用，被认为是DCM的治疗靶点，如AMPK激活剂二甲双胍除了作为经典降糖药，控制血糖、改善胰岛素敏感性，二甲双胍还能激活AMPK和下游的过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptors α，PPARα)，减少细胞氧化应激水平，降低ROS释放，减少NLRP3炎症体介导的炎症反应[14,24]，减少心肌细胞凋亡，改善心室重构及心功能不全。AMPK激动剂的研究可能为治疗DCM带来新的方向。此外，植物提取的多酚白藜芦醇一方面通过抗糖尿病和抗氧化作用，改善糖尿病小鼠的心脏舒张功能障碍，另一方面诱导自噬、抑制线粒体损伤，减少炎性体活化。目前的研究普遍认为，胞内K+的水平与炎症小体的激活密切相关，细胞受损，K+外流导致NLRP3的装配活化，而胞内β羟基丁酸乙酯可以抑制K+外流，抑制NLRP3炎症小体活化。未来需要更多的研究，发现抑制K+外流药物，从而从源头上减少炎症激活问题。H3松弛素是松弛素肽家族的一员，在体外和各种心脏纤维化模型中都具有抗炎和抗纤维化作用。研究发现，H3松弛素除了能减少糖尿病鼠心肌细胞凋亡和纤维化程度以外，还能直接抑制NLRP3炎症体的活化，从而抑制心肌细胞损伤[25]。值得注意的是，研究发现一些miRNA的改变与DCM的发生、发展密切相关，如通过对microRNA-223等miRNA的调控，能够下调NLRP3炎性小体活化、caspase-1的表达，从而抑制细胞凋亡。miRNA数量众多，作用机制未被阐明，未来需要在阐明其分子机制的基础上，开发出能够靶向于miRNA的高选择性、高特异性药物应用于DCM。

6 总结与展望

由于DCM患者的高死亡率，研究其发病机制并开发靶向药物对预防和延缓疾病的发展具有重要的意义。炎症小体NLRP3参与了DCM炎症反应，同时NLRP3的活化可能对心肌损伤有重要影响，NLRP3在DCM的病理生理中扮演了重要角色。尽管对其的研究取得了成果，仍有许多问题亟待解决,NLRP3蛋白激活中的大量未知机制，炎性小体与其他信号通路的交联反应，在DCM领域仍是有限的。未来需要加深对机制的透彻研究，早日发现针对DCM的靶向药物。