认识非洲猪瘟及其窗口期检测的重要意义

钟建舟

（宁乡市东湖塘镇农业综合管理服务中心，湖南 宁乡 410612）

非 洲 猪 瘟(African Swine Fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)引起的一种猪的急性、烈性、高度接触性传染病,严重危害着全球养猪业的健康发展。我国将非洲猪瘟列为一类动物疫病，是烈性外来疫病，其强毒力毒株对生猪致病率高，致死率100%。自2018年8月3日辽宁省沈阳市沈北新区发生第1 起疫情以来，截至2019年4 月23 日，农业农村部已经公布的疫情共129起，疫情累计捕杀生猪达到102 万头，我国除了港澳台的31 个省区市已经全部发现非洲猪瘟疫情[1]。面对如此严峻的疫情形势，早发现早诊断ASFV 感染生猪，可以为广大养猪场防控非洲猪瘟疫情赢得先机。

1 非洲猪瘟病毒特点和临床症状

1.1 病毒特性及疫苗研发瓶颈

ASFV 是非洲猪瘟病毒属中一种大颗粒、有囊膜的病毒，直径175 ～215 nm，核衣壳蛋白呈20 面体对称，直径180 nm，基因组由单分子线状双股DNA 组成，长度为170 ～190 kb。DNA 分子具有共价的闭合末端、反转重复区和发夹结构，编码200 多种蛋白质[2]。感染ASFV 后会造成家猪和一些野猪种暴发出血性疾病。在遗传学上，该病毒是一种复杂的双股DNA 病毒，包含用于致病、免疫逃逸和细胞过程调制的一系列基因。根据p72 基因的部分序列，科技人员已发现此病毒有23 个基因型。

ASFV 体积庞大，基因组结构复杂，抗原种类繁多，已经失去了成为高效疫苗的基础条件。在非洲猪瘟的预防和治疗方面，纵使世界各国的科学家孜孜不倦地努力并花费巨资开展研究，仍然收效甚微，国际上勉强推出的试验性疫苗也最终被证实有害无益。

1.2 病毒传播和临床症状

ASFV 可以通过与感染动物——家猪或者野猪——直接接触传播，或者通过来自感染动物的污染物或生肉的间接接触传播，抑或是通过节肢动物媒介，尤其是钝缘蜱属的软蜱间接传播。ASFV 在蛋白质环境中高度稳定，且对高温的抵抗力相当强，需要在60 ℃下经过20 min 才能失活。ASFV 在家猪之间的传播主要通过上呼吸道感染发生，因为已有研究证明家猪可以通过它的所有分泌物和排泄物排出有感染性的病毒，ASFV 在感染家猪的口鼻液中浓度尤其高。被病毒感染的猪死亡后，ASFV 在死猪的血液和组织中能够持续存活非常长的时间，因此，给猪饲喂生的泔水会导致ASF 的传播。病死猪剖检后的污染扩散、感染猪群打架后的流血和感染后的便血可能会成为ASFV感染的新路径。空气传播途径已在动物高密度饲养的实验室环境中被证实。

在我国ASF 属于“粪口传播”的疾病，放任大量的病猪进入屠宰厂污染环境、污染泔水、污染饲料，一旦源头治理失守，ASFV 便随着带毒仔猪、污染猪肉和污染饲料流通向各地，势必使非洲猪瘟疫情将成燎原之势。

ASF 临床病变可以通过多种途径表现，从无征兆的死亡(最急性型，死亡率约100%)到无症状感染；然而，ASFV 的大多数分离株会使家猪出现急性出血热，并引发近100%的死亡率。研究发现所有年龄段的猪对ASFV 感染均表现出相同的易感性，这与经典猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)不同——幼龄猪更易感CSFV。ASFV 急性感染是由强毒株造成的，其典型的特征性症状表现为高热、食欲减退、昏睡、虚弱、卧地不起、腹泻和/或便秘、腹痛、出血症、呼吸困难、流涕和流泪以及妊娠母畜的流产[3]。感染ASFV 的猪只死亡时间通常出现在临床症状出现后的7～10 d。根据ASFV毒株的毒力，急性感染通常是无该病区域开始暴发疫情时的主要形式；然而，该病一旦发生，通常会发展成为长期持续存在的亚急性临床型。中等毒力的ASFV 毒株会引发亚急性感染(通常幼龄猪表现出高死亡率，年龄较大的猪死亡率较低)，临床症状通常包括流产、发热、短暂性出血，在3 ～4 周内死亡或恢复。慢性感染的猪死亡率非常低，病猪以间歇热或低热、食欲减退和精神沉郁为特征；在某些情况下，会引发致死性感染。感染维持数月的病猪，如病毒储库、亚临床症状或慢性感染的猪，可能对疾病在流行地区持续存在起一定作用。

1.3 窗口期检测的重要意义

窗 口 期（Window Period）是指自感染开始至病毒抗原或抗体检出之间的间隔期。病毒进入机体后通过特殊免疫反应产生抗体，所以检测病毒抗原的窗口期短于病毒抗体的窗口期。在窗口期内虽然检测不到血液中的ASFV，但猪只体内已存在该病毒，通过消化道感染的ASFV 主要集中在口腔等黏膜组织内，处于局部感染（local infection）阶段，属于局限性的隐性感染（silent infection）过程。窗口期的感染猪同样具有传染性，但传染性不强。ASF 的窗口期平均为28 d，抓住窗口期的有利时机是目前净化和控制ASF 的唯一必要手段[4]。

2 窗口期检测非洲猪瘟的技术要点

2.1 检测方法的选择

由于病原窗口期短于抗体窗口期，所以我们选择的是直接检测ASFV。ASFV 检测的方法有聚合酶链式反应（PCR）法、荧光定量PCR 法、环介导等温扩增法和免疫层析胶体金快速检测法，其中较成熟的是PCR 和荧光定量PCR 法。传统PCR 法是用琼脂糖凝胶电泳或者分光光度计测定核酸浓度，其结果不准确而且易污染，实时荧光定量PCR 可以解决这些问题，它的准确性好、灵敏度高且无污染，对一些传染性疾病可进行定量分析、病原微生物和病毒含量检测，此项技术都是首选[5]。2019年6月11日，中国动物疫病预防控制中心发布了通过专家评审的ASF 现场快速检测试剂名单的34 个产品中，有28 个采用荧光定量PCR 法。

2.2 检测样本的选择

实践中我们常采集口腔拭子和鼻腔拭子作为窗口期的检测样本，这2 种拭子的采集便于操作，只需要用棉签在生猪口腔或鼻腔中来回旋转，沾取口鼻分泌物后放入相应保存液中即可。但是有报道称新鲜分泌的唾液具有更大的检测优势，其病毒含量远远高于口腔拭子和鼻腔拭子，新鲜分泌的唾液中非洲猪瘟病毒CT 值比口鼻拭子中的非洲猪瘟病毒CT 值平均低5 左右[4]。这就意味着新鲜分泌的唾液病毒含量要比口鼻拭子高约32 倍。

2.3 检测样本的处理

处于窗口期的生猪具备较强的免疫能力，采集的拭子和新鲜唾液中有活性较高的酶，尤其是唾液中酶，当病毒含量较低时很快就会被酶降解，从而导致假阴性结果的出现。抑制酶活性的保存液是至关重要的，同时低温保存也能有效地抑制酶的活性。由于处于窗口期的样本中ASFV 含量较低，有报道称对生猪采样之前进行禁食12 h 处理可以获得优质的样本。研究证实，试管中的病毒在静置或者离心状态下，底部的ASFV 含量远远高于试管上清液中的病毒含量，所以建议在采集样本时从试管底部取样进行检测[4]。

2.4 检测试剂盒的选择

试剂盒最重要的是准确性、敏感性、时效性和可重复性。因为窗口期样品病毒含量低，对检测试剂盒质量要求更高，用户在选择时要严格筛选。国产的荧光定量PCR 试剂盒中分为两类：磁珠法提取核酸后进行PCR 检测和免提取PCR 检测。免提取PCR 检测由于没有纯化过程，杂质对扩增反应影响较大，在对窗口期样品检测时效果不佳。采用免疫层析胶体金快速检测的快速检测卡，虽然操作简单快速，但是由于特异性不强，可信度较低，也不建议采用。

3 展望

非洲猪瘟进入我国后，国家公布的检测方法适用于已经发病猪群的临床检测，科学的非洲猪瘟窗口期检测对生猪生产和ASF 防控更具实践意义，种公猪、母猪和调运的仔猪应该成为窗口期检测的重点。窗口期的长短与检测技术的灵敏度有关，灵敏度越高，检测出ASFV的时间越早，有助于非洲猪瘟疫情的早发现、早诊断、早控制。随着对ASFV 认识的深入，相信在政府、科研人员和养猪从业者们的共同努力下，定能实现对非洲猪瘟的有效控制。