肿瘤细胞来源的外泌体对NK细胞活性的影响

崔雅楠 张传霞 金浩范

(吉林大学白求恩第一医院 1肿瘤中心，吉林 长春 130012；2转化医学院国际细胞治疗中心)

外泌体(exosome)是活的细胞经过一系列“内吞-融合-外排”等复杂的调控过程形成的有膜结构的小囊泡，直径30～150 nm，密度1.13～1.21 g/ml，存在于各种体液中，包括血液、尿液、脑脊液及母乳等。刚开始的时候，人们以为外泌体是细胞排泄废物的一种方式，外泌体的功能并未受到重视〔1〕。直到2013年诺贝尔生理和医学奖颁给了三位科学家，表彰他们在细胞内部囊泡(外泌体等)的运输调控机制方面的重大发现，这引起了更多研究人员对外泌体的兴趣，使外泌体的研究达到了空前的热度。随着分子技术的发展，人们渐渐认识到外泌体在细胞间物质交换和信息传递中的重要作用。近年来，国内外针对外泌体与肿瘤关系的研究主要集中在其促进肿瘤发生发展和抑制免疫系统两个方面。癌症来源的外泌体通过促进肿瘤细胞生长、调节肿瘤微环境、影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等多种方式参与肿瘤的诊断与治疗。外泌体也涉及肿瘤的免疫逃逸过程，它们可以影响免疫抑制细胞的分化和激活，调节抗原呈递，并诱导相关效应细胞的凋亡。自然杀伤(NK)细胞作为人体的重要免疫细胞，其杀伤活性不受主要组织相容性复合体(MHC)限制，不依赖于抗体，能快速溶解某些肿瘤细胞进而发挥抗肿瘤作用，因此NK细胞抗癌功能的开发与应用是近年来癌症研究的重点内容。根据相关文献报道，肿瘤来源的外泌体(TEXs)具有抑制NK细胞活性的作用〔2〕，本文将对此做简要综述。

1 TEXs的生物学特性

1.1组成 与大部分细胞产生的外泌体一样，TEXs也是由蛋白质、核酸及少部分脂类物质构成。其中蛋白质占据了很大部分，以参与外泌体本身基本结构构成的蛋白质和不同肿瘤细胞来源的特异性蛋白质为主，前者常见有多泡小体(MVB)相关蛋白、凋亡相关基因-2相互作用蛋白(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)及四糖蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82等，已被广泛用作外泌体标志物，用以检测及鉴别外泌体；后者与所覆盖的具体肿瘤类型有关，常见的有自杀相关基因配体(FasL)、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)和转化生长因子(TGF)-β等肿瘤抗原和免疫抑制蛋白。

除蛋白质外，TEXs还含有大量的mRNA和miRNA。这些核糖核酸类物质可以通过转运作用于靶细胞影响其基因表达，进而影响肿瘤的发生、发展，因此TEXs携带的不同mRNA和miRNA与癌症的早期诊断及治疗密切相关。例如，神经胶质瘤衍生的外泌体可以通过调节miR-1587作用于靶基因刺激肿瘤细胞增殖，相关研究也表明脑脊液中的外泌体含有的特异性RNA可以作为诊断中枢神经系统肿瘤的特异性标志物，在判断肿瘤分期及预后方面发挥重要作用〔3〕；P53突变的结肠癌细胞可以在肿瘤微环境中选择性释放富含miR-1246的外泌体，通过促进巨噬细胞的摄取转变为肿瘤激活状态，进而导致肿瘤细胞迁移，使TP53突变的结肠癌患者预后不佳〔4〕。这些发挥重要功能的核酸类物质，在外泌体中种类较多、含量丰富，与癌症细胞的自我调控息息相关，现已成为近年来研究的热点〔5〕。此外，外泌体包含的脂质成分主要来源于细胞的质膜，在某些生物学过程中也起到一定的调控作用〔6〕。

1.2功能 从已知的研究结果来看，TEXs由于成分不同、生物学特性的差异，分别从抑制和激活两方面对肿瘤起双重调控作用。

一方面，TEXs可通过多种途径诱导有效的抗肿瘤效应，激活免疫反应，促进肿瘤细胞凋亡等。如我国学者发现肝癌来源的外泌体可以将其特异性抗原传递给树突细胞诱发CD8+T细胞介导的杀瘤效应，为肿瘤的免疫治疗提供了新思路〔7〕。有研究发现卵巢癌细胞来源的外泌体可作为天然载体将CRISPR/Cas9质粒传递给癌症细胞，进而抑制poly(ADP-核糖)聚合酶1的表达，诱导癌细胞的凋亡〔8〕。关于胰腺癌细胞分泌的外泌体研究较多，早期实验发现它可以通过增加细胞内促凋亡蛋白Bax的含量、降低抗凋亡基因Bcl-2的表达，诱导多途径的细胞凋亡，如(PI3K/Akt)信号传导通路及Notch-1依赖的细胞凋亡途径〔9〕。近年来相关蛋白组学试验表明，胰腺癌来源的外泌体分泌的细胞膜表面含有大量的网蛋白，在细胞模型及动物试验中均证实该类蛋白可以抑制癌细胞增殖、侵袭和转移〔10〕。

虽然不断有研究发现TEXs具有一定的抗肿瘤潜能，但另一方面，更多的证据提示TEXs对预后不佳的晚期肿瘤发挥了免疫抑制作用，促进了肿瘤的进展，甚至与癌症细胞耐药性密切相关。例如：相关研究表明肝细胞癌(HCC)来源的外泌体通过传递14-3-3ζ蛋白至肿瘤浸润性T细胞(TIL)，抑制了TIL活化、增殖及抗瘤效应〔11〕；此外，肝癌来源的外泌体通过miR-1247-3p靶向特殊调控基因，诱导癌症相关的成纤维细胞活化，使肿瘤微环境分泌大量炎症因子促进肿瘤转移〔12〕；急性髓细胞白血病(AML)的外泌体可以下调骨髓造血干细胞的功能，这是通过促进抑制正常造血因子DKK1的表达实现的，它帮助建立适合恶性细胞成长繁衍的骨髓微环境促进白血病的进展〔13〕；在化疗耐药方面，乳腺癌细胞分泌的外泌体通过具有独特的90 kD形式的血管内皮生成因子(VEGF)激活促进肿瘤血管生成，且这种外泌体相关的VEGF与VEGF的靶向药物贝伐单抗的结合能力差，进而引起贝伐单抗药物的耐药〔14〕。

随着实验技术水平的提高及外泌体提纯技术的发展，越来越多的证据表明肿瘤的产生、侵袭和迁移与外泌体的关系十分密切。在肿瘤的免疫调节过程中，外泌体的物质交换与信息传递功能在癌症细胞和免疫细胞中发挥了双重作用。

2 TEXs对NK细胞功能的影响

NK细胞的发现距今已有40多年，它是机体固有免疫重要的毒性细胞，近年来随着肿瘤精准治疗的提出及免疫治疗的兴起，NK细胞因其杀伤活性不受MHC的限制、不依赖抗体的特点而倍受学者关注与研究。NK细胞具有抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的功能，此外，在某些情况下，NK细胞与自身免疫性疾病和超敏反应的发生也有一定的关联。作为机体抵御肿瘤和病原体的第一道防线，TEXs对NK细胞功能的改变及其机制值得深入研究。

NK细胞的杀伤效应与免疫清除功能的发挥由它表达的各种受体分子和相应配体之间的关系所决定，其活性取决于细胞表面的活化性受体和抑制性受体之间的平衡〔15〕。NK细胞的识别和杀伤效应机制主要有自身天然的细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)及NK细胞通过释放颗粒酶和穿孔素等细胞毒颗粒，活化NK细胞表达的FasL配体和TRAIL分子诱导细胞发生凋亡等。NK细胞也可以通过产生除了颗粒酶和穿孔素外的细胞因子(如IFN、TNF、IL-1、IL-5、IL-8、IL-10等)及NK细胞受体家族，常见如免疫球蛋白超家族(KIR和KAR)、C型凝集素受体家族(NKG2D)等对NK细胞活性进行调控。NK细胞的功能也与其不同亚群(如CD56lim和CD56bright)相关。

癌症患者的NK细胞介导低水平的抗肿瘤活性和低含量的激活受体，如NKp30、NKp46、NKG2C和NKG2D，相关研究表明该现象与TEXs密切相关〔16〕。

据报道，前列腺癌细胞来源的外泌体通过下调NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的受体NKG2D的表达，抑制免疫细胞的杀瘤效应，诱导免疫逃逸进而促进肿瘤细胞的生长和迁移〔17〕。经检测，由AML患者的血清中分离出来的外泌体富含大量的CD33、CD34、CD117和TGF-β1，它们抑制NKG2D受体的表达和诱导Smad磷酸化，进而影响了NK细胞活性，当中和TGF-β1时，这种抑制情况就消失不见了〔18〕。由此我们推测，AML细胞来源的外泌体相关的TGF-β1会下调NK细胞活性，对NK细胞功能有抑制作用，甚至对其他血液肿瘤及实体瘤也存在该机制可能。

肿瘤衍生的外泌体可以通过降低机体免疫力，改变肿瘤微环境，进而诱导肿瘤细胞的增殖和转移；相反，免疫细胞来源的外泌体可以通过增强机体免疫力对抗肿瘤。在一项较新的实验〔19〕中，研究者将神经母细胞瘤患者的肿瘤细胞扩张后在体内分离出的NK细胞来源的外泌体，并在此基础上对其进行体外培养进而探索其肿瘤本身的效能。发现暴露于神经母细胞瘤的NK细胞来源的外泌体能够表达CD56、NKG2D和KIR2DL2受体，对比正常细胞来源的NK细胞分泌的外泌体，前者对神经母细胞瘤的细胞毒性作用更大。韩国庆北国立大学医学院研究组探讨了NK细胞来源的外泌体在体内外对黑素瘤的抗瘤效应。该研究发现，对正常细胞没有影响的NK细胞来源外泌体对黑色素瘤细胞具有细胞毒性。在体外，通过FasL抑制剂可以减轻NK细胞来源外泌体对黑色素瘤细胞的杀伤效应，诱导黑色素瘤的凋亡。在体内，研究人员通过建立小鼠模型，发现外泌体处理组的肿瘤显著小于对照组，证实了NK细胞外泌体的肿瘤抑制作用，该研究为肿瘤免疫治疗提供了新思路〔20〕。

3 结 语

在TEXs的相关研究中，既往的研究多数是探索癌症细胞释放的外泌体对肿瘤本身的影响，但较少了解其对免疫功能尤其是NK细胞的影响。NK细胞作为机体免疫的重要屏障，其功能的研究与活性的调控对肿瘤的发生、发展至关重要。在细胞水平上证明TEXs对NK细胞活性的影响，何种成分，蛋白质、核酸还是脂质，何种作用机制导致的TEXs对NK细胞活性的改变更值得进一步的研究。可以预见，随着外泌体蛋白组学及基因组学的发展、提纯技术的提高，人们对外泌体，乃至整个细胞囊泡系统在肿瘤发生发展过程中的机制及肿瘤细胞与NK细胞之间的调控将进一步深入阐述，外泌体的临床应用将具有更广阔的空间和更良好的前景。