黄芩药材的微乳薄层色谱鉴别方法研究*

潘弟仪，陈金兴，黄晓冰，吴 涵，王 凌

（广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510360）

微乳薄层作为新型色谱技术，展开效果好，色谱性能稳定，重复性好，可用于中药材、中药饮片和中成药的分离鉴定［1］。微乳是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水按适当比例自发形成的无色透明、各向同性、低黏度的热力学稳定体系［2］，具有很大的表面积、强大的增溶效果及超低界面张力有利于提高色谱的分离效率［3］。微乳薄层色谱法目前处于初创阶段，研究基本上是单纯改变微乳液含水量对微乳进行优化［4-8］，不能全面反映其他成分对分离效果的影响，因此方法学存在明显缺陷。2015年版《中国药典（一部）》的黄芩药材薄层鉴别方法采用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）为展开剂，展开剂极性差异大，不易混合均匀，容易分层，影响展开效果。本研究中采用微乳液为展开剂，通过优化微乳液各成分比例，全面分析了微乳液中各成分对微乳薄层展开效果的影响，筛选能用于黄芩药材薄层鉴别的最优微乳展开剂，效果较好。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

WFH-203B型暗箱式三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；MSE125P-OCE-DU型电子分析天平（赛多利斯公司）；超声波清洗机（宁波海曙科生超声设备有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；10 μL定量毛细管（北京先驱威锋技术开发公司）。

1.2 试药

黄芩苷对照品、黄芩素对照品均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供，纯度高于98%；黄芩对照药材（广东省药品检验所，批号为120955-201309）；黄芩药材（产地河北，岭南药业有限公司，批号分别为1603002，1605001，1607001）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

称取黄芩苷和黄芩素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含1 mg和0.5 mg的溶液，作为黄芩苷及黄芩素对照品溶液。取黄芩对照药材及黄芩药材，按《中国药典》方法制成对照品溶液及供试品溶液。取十二烷基磺酸钠（SDS）加纯化水搅拌溶解，加入正丁醇、正庚烷，混匀成均一溶液，放置24 h即得微乳液。取微乳液加入适量改性剂甲酸搅拌成均一溶液，作为展开剂。

2.2 薄层层析

取2.1项下溶液样品10 μL，分别点于聚酰胺薄膜上，分别以各微乳液或甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3 ∶1 ∶2）为展开剂（需预饱和 30 min），展距为 8 cm，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在对照品溶液相应位置上显相同暗色斑点。微乳薄层紫外光检视后，喷以2%FeCl3乙醇溶液，日光下检视，观察斑点个数。

2.3 单因素试验考察展开剂效果的影响

2.3.1 甲酸

取微乳液［SDS-正庚烷-正丁醇-水（27∶63∶10∶300，W／W）］，加入甲酸，得系列溶液（10 ∶0，9.5 ∶0.5，9 ∶1，8.5 ∶1.5，8 ∶2，V／V），混匀作为展开剂，按 2.2 项下方法进行薄层层析，展开效果见表1。可见，随着微乳液展开剂甲酸比例的增加，黄芩苷和黄苷素的Rf值均逐渐增大，各斑点间分离度更好，但展开斑点出现拖尾、扩散现象；随着甲酸用量的逐渐增加，展开时间也逐渐缩短。微乳液-甲酸（9∶1）斑点的分离度好，展开时间适中，故确定甲酸用量为10%。

表1 甲酸对黄芩药材展开效果的影响

微乳液含水量：固定SDS-正丁醇-正庚烷（27∶63 ∶10，W／W），配制含水量为 50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%（W／W）的系列微乳液，以微乳液-甲酸（9∶1）为展开剂，按2.2项下方法进行薄层层析，展开效果见表2。可见，随着微乳液含水量的增加，Rf值逐渐降低。微乳液含水量增大，分离度显著降低，展开斑点减少，并出现扩散拖尾现象，但含水量过低时，紫外光下暗色斑点模糊，不利于观察，且展开时间显著增加，亦不利于薄层层析。微乳含水量为75%时，各斑点分离效果理想，展开时间适中，故确定微乳含水量为75%。

SDS：固定正丁醇-正庚烷 -水（63∶10∶300，W／W），SDS 取 4.00，5.00，6.00，6.75，8.00，9.00 g，加纯化水75 mL 溶解，加入正丁醇 15.75 g，正庚烷 2.5 g，配制成系列微乳液，以微乳液-甲酸（9∶1）为展开剂，按2.2项下方法进行薄层层析，展开效果见表3。可见，随着SDS用量的增加，Rf值稍有下降。SDS用量为4.00 g时，斑点稍有扩散；用量增加到8.00 g时，紫外光下暗色斑点逐渐变得模糊，展开时间也逐渐增加，不利于薄层层析及结果的观察；SDS用量为 5.00～6.75 g时，各斑点分离效果理想，斑点清晰，展开时间适中，均可作为微乳液中SDS用量。

表2 微乳含水量对黄芩药材展开效果的影响

表3 SDS对黄芩药材展开效果的影响

正丁醇：固定 SDS-正庚烷-水（27∶10∶300，W／W），分别取 SDS 6.75 g，正庚烷 2.5 g，纯化水 75 mL，正丁醇用量分别为 11.00，13.00，15.00，15.75，17.00，19.00 g，配制成系列微乳液，以微乳液-甲酸（9∶1）为展开剂，按2.2项下方法进行薄层层析，展开效果见表4。可见，正丁醇用量对黄芩药材展开效果影响并不大，正丁醇用量在11.00～17.00 g时，各斑点分离效果理想，斑点清晰，均可作为微乳液中正丁醇用量。

表4 正丁醇对黄芩药材展开效果的影响

正庚烷：固定 SDS-正丁醇 -水（27∶63∶300，W／W），分别取 SDS 6.75 g，正丁醇 15.75 g，纯化水 75 mL，正庚烷用量分别为 1.0，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0 g，配制系列微乳液，以微乳液-甲酸（9∶1）为展开剂，按2.2项下方法进行薄层层析，展开效果见表5。可见，正庚烷用量对黄芩药材展开效果影响并不大，正庚烷在2～5 g时，各斑点分离效果理想，斑点清晰，均可作为微乳液中正庚烷用量。

表5 正庚烷对黄芩药材展开效果的影响

2.4 与普通有机溶剂系统的比较

以微乳液［SDS-正丁醇-正庚烷-水（27∶63∶10∶300，W／W）］-甲酸（9∶1）为微乳展开剂，另按药典方法以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）为普通有机溶剂系统展开剂，按2.2项下方法进行薄层层析，结果见图1。可见，微乳液的薄层层析与普通溶剂系统比较，分离度相当，但斑点更清晰、圆整，且操作简便，试验条件宽容，展开稳定性好，更适用于黄芩药材的薄层鉴别。

图1 薄层色谱图

3 讨论

微乳液是一个复杂的多组分体系，可变因素较多，明确各因素对色谱分离的影响，对提高分离效率至关重要。微乳展开剂的构成绝大部分为SDS-正丁醇-正庚烷-水［3-9］，但未系统阐明微乳液各成分对展开效果的影响。前期试验也证实，该微乳液体系更适用于黄芩药材的薄层分离。由本研究结果可见，微乳液含水量对薄层层析效果影响最大，含水量低可提高物质的分离度，但同时也因展开剂黏稠度增加而使展开时间显著延长，不利于薄层层析；另外，其他因素对薄层层析物质的分离度均无太大影响，但各成分比例不同会影响色谱图的清晰度。其中，甲酸、SDS用量会对展开时间产生影响，故需综合图谱的清晰度及展开所需时间而筛选最优配比。

微乳液［SDS-正丁醇-正庚烷-水（27∶63∶10∶300，W／W）］可作为黄芩药材鉴别的新型展开剂，该微乳体系也是目前报道采用最多的微乳展开剂［6-9］，可用于多种药材的黄酮类成分及中成药制剂中多种成分的薄层分离鉴别。因此，可初步推断采用该配比微乳液即可大致判断微乳展开剂是否适用于其他药材及制剂的薄层层析，可用于多种药材及制剂微乳薄层适用性考察，为微乳薄层推广应用提供简便的筛选方法。

值得注意的是，除了SDS-正丁醇-正庚烷-水组成的微乳液外，亦可采用其他微乳体系对中药材进分离鉴定［10-11］。本研究结果对微乳体系中表面活性剂、助表面活性剂、油相种类的筛选均有较大的研究意义，今后需加强研究，进一步推广微乳薄层在中药分离鉴别中的应用。