代谢组学在类风湿关节炎中应用的研究进展

卢靖珊，杨 渐,2，许 盈,2，俞昌喜,2

(1. 福建医科大学药学院，2. 福建省天然药物药理学重点实验室，福建 福州 350108)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性炎症性疾病，主要表现为持续性的滑膜炎症和关节软骨损伤[1]。患病率较高，全球约为0.5%～1.0%，我国患病率约为0.3%～0.4%，主要患病年龄为40～60岁，女性高发，患病率约为男性的3倍[2]。该病导致关节软骨的渐进性破坏，病情严重者可出现关节僵硬、关节畸形、关节强直，甚至关节脱位，致残率极高，若未及时进行诊断治疗，患者将丧失劳动能力，给社会造成巨大的经济负担。由于RA的病因不明，发病机制复杂，对RA的深入研究有助于进一步深入理解RA的病理生理学特点，以及进一步寻找其潜在的诊断或治疗靶标。近年来，越来越多的学者将新兴的代谢组学技术应用于RA的研究中，现就其研究进展进行综述。

1 代谢组学研究技术的概述

代谢组学是从20世纪末开始迅速发展起来的，对某一生物或细胞中小分子内源性代谢产物进行定性和定量分析的一门新兴学科。作为系统生物学的重要组成部分，代谢组学继承了基因组学和蛋白质组学的“组学”研究思路，生物体内所有的代谢产物都需要分析，即从整体上研究机体受外界环境干扰后，其内源性代谢产物种类及数量的变化规律，全面地体现生物体对相应刺激的响应机制，具有即时、灵敏、全面等特点。其分析手段主要是应用现代分析技术(如核磁共振、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、毛细管电泳-质谱联用等)，定性、定量地检测生物样本中的小分子内源性代谢物，通过结合化学信息学等技术，考察生物体在生理及病理状态下或药物干预前后，其内源性代谢产物的变化，寻找到疾病潜在的具有特异性的生物标记物，从而阐明药物的作用机制、揭示疾病的发病机制，为疾病的诊断与治疗提供参考[3]。

2 代谢组学在RA相关研究中的应用

2.1 揭示RA的早期生物标志物RA早期生物标志物是从机体血液或其他体液、组织液中发现的某种成分，作为RA的一种发生信号，能用于健康人群的筛检及RA患者的早期诊断和治疗反应预测[4]。利用代谢组学的研究方法，寻找具有特征性的RA早期生物标志物，是代谢组学在RA研究中主要的目的。

目前，国内外针对RA早期生物标志物的代谢组学研究非常有限。C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是一种急性蛋白，当机体受到感染或组织损伤时，其含量会急剧上升，以清除入侵机体的物质，传统观点认为CRP是一种非特异性的炎症标志物。Young等[5]采用基于核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技术的代谢组学研究，发现早期RA患者血清中的CRP较健康人群明显增多，通过结合早期RA的症状及含量异常的代谢物等因素，可对早期的RA进行分期。Surowiec等[6]采用LC-MS的代谢组学研究方法，分析30例RA早期患者和19例健康人群的代谢物谱。研究发现，在RA早期患者的血浆样本中可以检测到脂类物质的变化，神经鞘磷脂(sphingomyelin，SM)与溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidyl- choline，LPC)的含量在RA早期患者体内较对照个体内处于更高的水平，且随着RA的发生与发展，SM与LPC的含量也逐渐上升，提示SM与LPC是疾病强有力的预示因子，可用于反映疾病的病程进展。另有学者指出，SM与LPC在早期骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者体内的含量也异常升高，在鉴别诊断早期RA与早期OA上，未找到差异性物质[7]。Michopoulos等[8]采用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)的代谢组学研究方法，在Tg197转基因关节炎小鼠模型上进行RA的相关研究。通过小鼠的后肢提取物代谢谱图发现，对照组(野生型健康小鼠)和Tg197小鼠之间的代谢表型具有明显的差异，甲叉琥珀酸(itaconic acid)仅在Tg197小鼠中检测到，表明甲叉琥珀酸与RA的发生有直接联系。当Tg197小鼠接受抗RA生物药英夫利昔单抗治疗时，其体内甲叉琥珀酸的浓度变化有所减缓甚至逆转，从而发现RA潜在的早期生物标志物甲叉琥珀酸。随后，为进一步确证甲叉琥珀酸为RA的早期生物标志物，并评估由动物模型得出的结论与人体的相关性，作者通过对18例RA患者的人成纤维细胞进行人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor，hTNF)处理，发现经hTNF处理的人成纤维细胞内存在大量的甲叉琥珀酸，而其对照组中未检测到。研究显示，甲叉琥珀酸在所有受检标本中均与疾病表型有很强的相关性，证实了甲叉琥珀酸在RA早期诊断的价值，为RA的早期诊断提供了理论依据。

2.2 发现RA标志物逆推完善通路机制众所周知，基因组学和蛋白质组学分别是从基因与蛋白质的水平来研究生物体生命活动的学科。然而，机体内有许多生命活动与代谢物的含量密切相关。代谢物可反映生命过程中发生的一系列的生物化学反应，代谢物的变化正是机体体内变化过程的反映。利用代谢组学寻找到RA潜在的生物标志物，通过其代谢通路逆推找出其调节酶和调控基因，完善疾病的通路机制，对RA发病机制的深入理解具有重要的指导意义。

NLRP3炎性小体是固有免疫的重要组成成分，在机体的免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用，Guo等[9]报道了NLRP3与RA的发病机制相关。Pang等[10]在胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠中进行甲氨蝶呤对RA炎症抑制作用的代谢组学研究，发现甲氨蝶呤主要是通过抑制核转录因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和NLRP3/caspase-1通路，下调通路相关的细胞因子水平，抑制促炎性脂质的释放，促进抗炎性介质的产生，从而调节炎症相关的代谢网络，减轻CIA大鼠的炎性肿胀，抑制关节组织炎症的发生。

Yang等[11]通过代谢组学研究发现，RA的发病机制可能与能量代谢异常有关，进一步通过定量检测与能量代谢相关的蛋白质，发现在RA患者体内磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDHA)等厌氧分解代谢酶有所上调，而有氧氧化和脂肪酸氧化的酶有所下调(如柠檬酸合成酶、二氢硫辛酰胺转琥珀酰酶、磷酸葡萄糖酸脱氢酶、长链脂酰CoA合成酶、长链烯脂酰辅酶A脱氢酶等)。缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)可参与机体的炎症反应，改善机体的炎症状态，通过敲低HIF-1α的表达，发现成纤维样滑膜细胞中的有氧氧化酶和脂肪酸氧化酶的表达减少，而厌氧分解代谢酶的表达有所增加。研究结果表明，滑膜液中葡萄糖和乳酸可用作诊断RA的可靠生物标志物，由HIF-1α通路调节的厌氧分解代谢增强和有氧代谢减少是促进RA进展的重要因素。该研究利用代谢组学技术，完善了从代谢物到上游调节酶与调控基因的通路机制。

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是一种由激活的单核巨噬细胞产生的，能够抑制成骨细胞及刺激破骨细胞的细胞因子，多项研究指出，TNF是治疗RA的一个重要靶标[12]。Narasimhan等[13]应用基于1H-NMR的代谢组学研究方法，分析19例RA患者的血清代谢物谱，寻找与滑膜标记基因表达相关的血清代谢物，研究提示血清中的代谢物与滑膜组织中的细胞因子簇具有一定的相关性。血清中胆碱和葡萄糖水平与滑膜组织中TNF-α和CD3分化簇(cluster of differentiation3，CD3)基因的表达呈负相关，血清中琥珀酸酯通过抑制脯氨酸而促进炎症细胞因子IL-1β的表达，与滑膜组织中的IL-1β基因的表达呈正相关。研究结果提示，除TNF-α外，滑膜组织中的CD3ε和IL-1β基因的表达也与RA的发病密切相关。研究表明，代谢物不仅可以作为炎症滑膜组织引起的紊乱的生物标志物，还可以用于预测滑膜组织中与RA相关的基因表达，进而完善RA发病的通路机制，充分说明了代谢组学技术在RA发病机制研究中的独特优势和潜力。

2.3 阐明RA疾病的发病机制RA的发病与多种因素相关，其发病机制目前尚未明确，要探究复杂的RA发病机制需要对机体的代谢物组有全面的了解。利用代谢组学技术全面、即时、灵敏的研究特点与优势，从代谢角度阐明RA的发病机制，更系统全面地揭示RA的发病机制。

2.3.1RA发病与能量代谢异常相关 乳酸、丙酮酸、柠檬酸等是与能量代谢过程有关的产物，Zheng等[14]采用佐剂关节炎(adjuvant-induced arthritis，AIA)大鼠模型模拟人体急性关节炎的发病过程，发现AIA大鼠体内的丙酮酸、乳酸水平相对升高，而柠檬酸的含量相对减少。在氧供应相对不足时，机体通过葡萄糖不完全分解生成乳酸提供能量，乳酸水平的升高说明了AIA大鼠体内的糖无氧酵解异常加强。柠檬酸是三羧酸循环的重要中间代谢产物，柠檬酸含量的相对减少提示AIA大鼠体内的糖有氧代谢部分受到抑制。Shan等[15]在CIA大鼠上同样观察到能量代谢紊乱的现象。此外，Yang等[11]通过分析比较25名RA患者和10名健康受试者的滑膜液样品，发现RA患者滑膜液中葡萄糖、柠檬酸的浓度相对减少，而乳酸浓度明显升高，提示RA代谢物质差异的产生机制与无氧酵解和有氧代谢的失衡相关。由此可见，RA的发病机制可能与能量代谢异常有关。

2.3.2RA发病与脂质代谢异常相关 据报道，RA患者的心血管病死率是普通人的2倍，尤其是冠状动脉粥样硬化的患病风险增加，提示RA发病可能与脂质代谢异常有关。欧阳昕等[16]应用基于NMR谱的代谢组学研究方法，对30例RA患者及35名健康人进行了评估，脂质谱分析显示，RA患者体内存在一定程度的脂质代谢紊乱，其血清中高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、胆固醇和磷酸胆碱(phosphatidyl choline，PC)的含量相对减少，而低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)的含量相对增高。研究结果表明，胆固醇、乳酸、乙酰化糖蛋白和脂质是RA的候选生物标志物。HDL可将蓄积于末梢组织中的游离胆固醇与血液中的脂蛋白运送到肝脏组织，以维持细胞内胆固醇含量的相对恒定，HDL含量的减少，使胆固醇在体内累积，促进机体的炎症反应。体内的LDL主要由VLDL转变而来，其主要功能是运载胆固醇进入全身各组织细胞，当机体内的LDL过量时，它所运载的胆固醇便会积存于血管壁上，对血管内膜造成炎症样刺激，从而加速了RA的发生和发展。此外，Giera等[17]通过脂质组学，定量分析RA患者滑膜液中溶血卵磷脂与卵磷脂类的含量波动，佐证了RA的发病与体内脂质代谢的异常相关。花生四烯酸(arachidonicacid，AA)是人体的一种必需脂肪酸，是多种生物活性物质的前体，具有重要的生物学作用，Wang等[18]在AIA大鼠上观察AA代谢的变化，发现AIA大鼠在环氧合酶(cyclooxygenase，COX)和脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)催化的AA代谢途径中，有19种代谢产物较正常组明显增加，治疗后则恢复到正常水平。Ding等[19]采用CIA大鼠进行血清代谢组学的研究，同样发现了AA代谢紊乱的现象，提示RA的发病机制可能与AA和磷脂代谢网络的失调有关。另外，Pang等[10]通过血浆代谢组学的研究方法，对CIA大鼠的代谢变化进行全面的评价，亦发现RA的发病与AA、亚油酸和鞘脂代谢异常相关。

2.3.3RA发病与氨基酸代谢紊乱相关 甘氨酸(glycine，Gly)是许多代谢反应中的关键化合物，甘氨酸受体(glycine receptor，GlyR)是一种重要的抑制性受体，分布在各细胞膜上(如单核巨噬细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞等)，并参与体内的免疫反应和炎症反应。Gly可通过与其受体结合，抑制这些细胞的活性，从而发挥抗炎作用。牛磺酸在抗氧化、维持膜稳定和调节渗透压等生物过程中起着重要的作用，可直接清除氧自由基，进而抑制氧化应激诱导的炎症反应。Yun等[20]发现，CIA大鼠血清Gly水平明显下降，而牛磺酸水平明显升高，紊乱的氨基酸代谢水平提示CIA大鼠体内存在炎症反应。Li等[21]采用LC-MS的代谢组学研究方法，测定30例RA患者和32例健康对照者的内源性代谢产物，发现RA患者血清中的谷氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-脯氨酸明显升高，而色氨酸、精氨酸的含量则明显下降。有研究报道，谷氨酸可能是RA的一种新的预测因子，与早期骨侵蚀有关[22]。色氨酸可以反映膝关节骨关节炎的存在和严重程度，与炎症反应密切相关[23]，色氨酸代谢的增加，提示了其机体内存在炎症反应。这些发现提示，RA患者体内的氨基酸分解代谢异常增强，紊乱的氨基酸分解代谢与炎症关节的低氧状态，限制了葡萄糖和其他大分子从血液扩散进入滑膜，导致脂质降解增加，酮体在滑膜内富集，最终致使RA的发生。

2.3.4RA发病与机体氧化应激相关 氧化应激是指机体内氧化与抗氧化作用失衡，抗氧化能力相对不足，机体的自由基异常增多，导致中性粒细胞炎性浸润，从而引起细胞和组织的损伤。Kim等[24]通过对RA和其他类型关节炎(强直性脊柱炎、贝特病和痛风)患者的滑膜液样品进行代谢分析，发现RA患者滑膜组织内的谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶含量相对减少，机体的抗氧化能力减弱，且自由基大量堆积，过量的自由基破坏了软骨细胞，使滑膜与骨质受损，最后导致RA的发生。He等[25]采用代谢组学结合超微弱光子发射(ultra weak photon emission，UPE)技术，研究CIA小鼠的炎症反应与氧化应激的关系。这些研究显示，RA的炎症反应和活性氧(reactive oxygen species，ROS)介导的血浆代谢产物的升高、胺代谢产物的系统性减少密切相关。ROS是机体在有氧代谢过程中的产物，过高的ROS水平会对细胞的结构造成损坏[26]，高浓度的ROS可通过未配对的自由基氧化各细胞及细胞外的部分，破坏细胞膜中多不饱和脂肪酸分子的丙烯双键，使细胞膜的流动性与通透性发生变化，最终使细胞整体结构破坏和功能紊乱，加剧机体的炎症反应，促使RA的发生。

3 结论与展望

综上所述，代谢组学技术凭借其高灵敏度、高准确度及全面性的研究特点和优势，在RA的早期诊断方面具有更好的可靠性和预见性，使快速的临床干预成为可能，为RA的预防、早期诊断和治疗提供新的思路。从代谢角度揭示RA的发病机制，对辅助临床RA的诊断及治疗具有重大的指导意义。未来随着检测技术和生物信息技术的不断改进与发展，代谢组学的研究方法不仅有望成为临床诊断RA的新工具，而且有助于理解该病发生的病理机制、观察其病情的发展与预后，具有广阔的应用前景。