Q热诊断技术研究进展

孙翔翔，朱 琳，陈 伟

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

Q热（query fever）是由贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）引起的一种自然疫源性人兽共患病。早在1937年，澳大利亚发生了一种发热性疾病，因不明原因，故在当时称为Q热，后来才证明其病原体为贝氏柯克斯体。贝氏柯克斯体是一种专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，对理化因素抵抗力强，可在外界环境中长期存活[1]。贝氏柯克斯体存在两种抗原相，根据菌体表面脂多糖组成的不同分为Ⅰ相和Ⅱ相。Ⅰ相病原体含有完整抗原组分，含光滑脂多糖，毒力强；经细胞或鸡胚多次传代后成为Ⅱ相，含粗糙脂多糖，毒力降低[2]。

该菌可通过气溶胶广泛感染人和动物，因此美国反恐组织将其列为生物战剂之一[3]。多种动物均能感染该菌，包括反刍动物、其他野生和家养动物、鸟类和节肢动物（尤其是蜱虫）等[4-7]。人感染Q热后有急性、慢性和亚临床等多种表现形式，急性型通常表现为自限性发热、肺炎和肉芽肿性肝炎等，用适当的抗生素治疗就能很快康复，慢性型一般出现心内膜炎、血管感染和肝炎等症状，需要用抗生素治疗2年或更长时间。动物感染Q热多为隐性经过，但可能会出现散发或暴发性流产、死胎或弱仔等繁殖紊乱症状，也可引起牛的不育和子宫炎症，而且可持续感染多年，甚至终生无症状带菌。迄今为止，Q热已经成为全球分布最广泛的人兽共患病之一，几乎世界上所有国家均有Q热感染的报道。1950年，我国报道了首例Q热病例。目前，Q热在我国大部分地区都有流行。本文主要论述了Q热诊断中常见的血清学和病原学技术，以期对该病的快速诊断和防控提供参考。

1 血清学诊断技术

1.1 补体结合试验（CFT）

CFT是有补体参与的，以绵羊红细胞和溶血素组成指示系统的免疫检测方法，是Q热抗体检测中特异性非常高的一个试验，被许多国家实验室采用。在牛群中，大多数补体结合抗体是lgG1抗体。1958年我国在内蒙古人群中发现Q热补体结合阳性抗体，同时在当地的牛羊血清中也检测到Q热抗体。Szymańska-Czerwińska等[8-9]对波兰 6个区域的151名农场工人血清，用CFT进行Q热抗体检测，发现平均血清阳性率为15.23%，对1 200只蜱虫进行检测，发现Q热感染率为15.9%。

1.2 酶联免疫吸附试验（ELIS A）

ELISA目前已经被广泛应用到Q热的血清学抗体检测中，是实验室最常见的检测方法之一，除了可以检测IgM和IgG抗体外，还可以检测IgA抗体，一般在临床症状出现后的2～3周，便可以检测到抗体。抗体通常会在几个月内增多，并可持续数年。武文君等[10]以贝氏柯克斯体弱毒株Ⅱ相全菌为包被抗原，建立了Q热贝氏柯克斯体间接ELISA检测方法，通过方阵滴定法，对抗原包被浓度等各项反应条件进行了优化，确定其阴阳性临界值为0.44，与市场上其他Q热抗体检测试剂盒符合率为94.66%。Klemmer等[11]用成品ELISA试剂盒，对埃及境内的牛、绵羊、山羊和骆驼血清进行Q热检测，结果发现在2 699份血清样品中，骆驼的血清阳性率最高，达到40.7%（215/528），其次是牛19.3%（162/840）。

1.3 间接免疫荧光法（IFT）

间接免疫荧光法是目前公认的Q热血清学诊断的参考标准。这种方法用于Q热感染的早期诊断，通常在出现临床症状的1～2周内就可以检测到抗体。孙长俭等[12]采集了辽宁省14个农村地区的人群血液标本，用IFT检测人血清中的Q热立克次体抗体，血清标本总阳性率为7.33%。Wegdamblans等[13]用CFT、ELISA 和IFT 3种方法检测了Ⅰ相IgG抗体、Ⅱ相IgG抗体和Ⅱ相IgM抗体，结果得出对3个月内的急性Q热感染诊断，这3种方法都有效，但对后期血清，IFT比其他两种方法能检测到更多的IgG抗体。

2 病原学诊断技术

2.1 细胞培养

细胞培养是病原分离中常用的技术，贝氏柯克斯体的传代和培养是采用绿猴肾细胞（BGM细胞）在特定无抗生素培养基中进行的。一般受感染的细胞在2 d左右其胞浆内会出现散在的病原体，5～7 d内病原大量增殖。甲醇固定后，用姬姆萨染色法可见紫红色小球状或短杆状体。目前，随着无生命培养基CCM及其衍生物ACCM、ACCM-1等的出现[14]，贝斯柯克斯体的培养进入了一个新的时代，也打破了常规认为贝氏柯克斯体是“专性胞内寄生菌”的认识。

2.2 PCR技术

PCR技术是目前分子生物学诊断中最常用的技术之一，在Q热的诊断中，由于PCR技术比血清学的诊断时间早，而且相对病原分离，操作简单、分离率高，因此目前已取代病原分离而成为直接诊断的依据。PCR技术包括常规PCR、多重PCR、巢式PCR和荧光定量PCR等。多重PCR是在常规PCR基础反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，其优点是能鉴定不同基因种型，并提高检出率；巢式PCR适合Q热的早期诊断，能提高PCR的敏感性和特异性；荧光定量PCR的优点是特异性高，反应时间短，而且能够做到定量检测。Maria-Guia等[15]用不同生物样本比较了巢式PCR和常规PCR方法，发现19个样本中只有巢式PCR检测到12个阳性。亚红祥等[16]用荧光定量PCR、巢式PCR和普通PCR方法分别对Q热htpAB基因片段进行检测，结果发现荧光定量PCR方法的灵敏度分别为巢式PCR和普通PCR的10倍和100倍，而荧光定量PCR耗时约1 h，巢式PCR耗时约2.5 h，普通PCR耗时约1.5 h。因此，荧光定量PCR方法具有很好的敏感性、特异性、重复性和可操作性。

2.3 环介导等温扩增（LAMP）

LAMP是一种新型核酸扩增方法。该方法是针对目的序列设计4～6对引物，在60～65 ℃条件下进行等温扩增，操作简便，对仪器要求极低。张琪等[17]利用体外合成的IS1111a基因构建重组质粒，建立了可视化LAMP反应体系，可准确区别贝氏柯克斯体重组质粒与新桥株，最低可检测到3.6×102拷贝/反应。Chen等[18]将LAMP试剂和荧光染料一起冻干，通过对贝氏柯克斯体质粒DNA的检测来测试其稳定性，结果发现这种改良后的试剂可以在4 ℃中保持24个月的稳定性。

2.4 重组酶聚合酶扩增（RPA）

RPA是一种新兴的核酸恒温扩增技术。该方法的原理是使用重组酶与引物结合形成复合物，该复合物会引发模板DNA快速合成，通常在25～42 ℃便可完成核酸的快速恒温扩增，特异性强、灵敏度高、反应快速。目前RPA也可与侧层析试纸条、探针、生物芯片等多种方法相结合进行检测，基于RPA建立的诊断方法在病毒、细菌、寄生虫等疾病诊断方面的应用越来越广泛[19]。Qi等[20]将RPA与侧层析试纸条相结合检测贝氏柯克斯体新桥株的23S RNA，最低可检测到10拷贝/反应的阳性质粒或7拷贝/反应的DNA。Koo等[21]建立的快速诊断方法可在20 min内进行DNA快速检测，对急性Q热样本的临床检测敏感性大于90%。

2.5 基因芯片

基因芯片技术以核酸杂交为基础，通过使用多种高度特异的探针来识别或检测不同物种，快速、特异和高通量[22]。焦俊[23]利用30个贝氏柯克斯体重组表面蛋白点制成1张蛋白芯片，经感染小鼠血清和Q热患者血清筛选出15个主要血清蛋白，可将其作为Q热血清学检测的候选诊断抗原和研发Q热亚单位疫苗的候选免疫原。Schmoock等[24]用建立的基因芯片方法筛选小反刍动物棉拭子、环境样品和人体样品，表明基因芯片技术可以快速有效地鉴定致病性种类和用于分型。

3 讨论

Q热宿主广泛，感染性强，可通过气溶胶传播，一旦流行很难控制。在我国，Q热是一类被忽视的烈性传染病，仅有少数几个实验室从事Q热研究，而且误诊、漏诊现象偏多[25]。究其原因，一是由于Q热临床表现形式多样，二是缺乏有效实验室诊断技术的鉴定和流行病学资料的验证。目前实验室诊断常用的血清学方法中，CFT操作步骤繁琐，很容易出现不正确结果；ELISA方法相对成熟，但影响因素复杂，容易出现结果失真；IFT特异性和敏感性都很高，对设备要求较高，不易普及。病原学诊断方法中，细胞培养需要高等级的生物安全实验室，且病原体不易培养；荧光定量PCR技术特异性和敏感性好，但操作成本较高。随着生物学技术的飞速发展，各种各样的检测方法已开始应用到Q热的诊断中，如LAMP、RPA和基因芯片等都有很好的发展前景。加强对Q热新型诊断技术的研究，从而研发出更加快速、特异和高效的诊断方法，必将为Q热的快速诊断和防控奠定基础。