骨肉瘤免疫靶向治疗相关机制的研究进展①

曾新歆 王胜涛 贵 鹏 吴 昊 李朝旭

(桂林医学院附属医院骨二科,桂林 541004)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)以局部疼痛、肿胀、活动受限为临床症状，以生长速度快、恶性程度高、转移时间早为发病特点。经传统外科手术治疗、新辅助化疗后患者生活质量降低、肿瘤易复发，是骨肉瘤治疗的主要困难。近来，骨肉瘤协作研究小组(Cooperative Osteosarcoma Study Group,COSS)和欧洲骨肉瘤协作组(European Osteosarcoma Intergroup,EOI)共同进行EURAMOS-1试验，探索经过标准新辅助化疗后疗效较差的骨肉瘤患者，若继续化疗，是否可以改善无事件生存率(Event-free survival,EFS)。该团队加用异环磷酰胺、依托泊苷及聚乙二醇化干扰素α-2b(Peginterferon alpha-2b,INF α-2b)后,局限性OS患者5年生存率为65%～70%，转移性OS患者5年生存率仅为19%～30%， EFS并未提高[1]，该研究表明使用普通化疗药物不能提高抗OS疗效。

免疫治疗指通过人为刺激提高宿主免疫反应，增加细胞杀伤毒性，继发性增强机体抗肿瘤免疫应答，杀灭癌组织，促进肿瘤细胞凋亡[2]。靶向治疗是在分子水平通过抑制或激活肿瘤生长所必需的重要通路，促进T细胞清除，加速肿瘤细胞凋亡[3]。靶向治疗后出现耐药、肿瘤复发等现象，对远期疗效有显著影响。研究发现，除了直接清除肿瘤细胞外，靶向治疗还能参与免疫调节过程，加速肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)启动[4]，增强免疫调节，持续高效性杀伤靶细胞。免疫联合靶向治疗可能存在协同机制，放大细胞毒性作用，抑制肿瘤耐药细胞形成[5]，解除细胞凋亡抑制，改善肿瘤微环境。

1 抗OS的免疫治疗

1.1抗OS治疗的免疫反应过程 将免疫学方法运用于抗OS治疗始于1891年[6]，科学家发现，提取处理后的细菌物质可影响肿瘤增殖。从单一药物单个靶点试验，到多药联合不同免疫反应过程相结合，经过上百年的发展，OS免疫治疗取得跨越式成功。经大量研究证实，免疫制剂通过免疫扩增的方法刺激机体免疫系统，增强宿主免疫反应，上调免疫应答强度，降低免疫耐受[7]。

抗OS免疫反应大致经过以下过程：最初树突状细胞(Dendritic cells,DCs)识别骨肿瘤特异性抗原，经主要组织相容复合体(Major histocompatibility complex,MHC)通路激活T细胞(主要为CD4+、CD8+T淋巴细胞)[8]，通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)介导以及大量共刺激分子共同作用，活化的肿瘤特异性T细胞转化为效应T细胞。此过程需逃避免疫检查点监控，克服大量免疫反应负性影响杀灭肿瘤细胞。免疫反应是多个过程相衔接，多信号共同刺激，层层递进，相互作用，对肿瘤进行长期稳定的破坏。

1.2免疫治疗OS的最新进展

1.2.1INF α-2b、IL-2、胞壁酰三肽(Liposomal form of muramyl-tripeptide-phosphatidyl ethanolamine,LM-TP-PE)制剂可调节机体免疫监视，放大特异性细胞毒杀伤作用，增强吞噬细胞活力，提高体液免疫与细胞免疫能力[9]，为稳定有效的免疫调节剂。L-MTP-PE类免疫治疗药物能够有效作用于环孢素，激活巨噬细胞，促进OS细胞凋亡，临床数据表明此类药物亦能提高患者5年生存率[10]。因此，激活吞噬细胞活力可用于抗OS治疗。

1.2.2免疫检查点是存在于免疫系统中的一些抑制性信号通路，通过调节机体免疫反应减少组织损伤，增强自身抗原耐受。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)为T淋巴细胞表面的一种抑制性因子，与配体特异性结合，致其信号分子磷酸化，抑制T淋巴细胞活化。当TCR受刺激，CTLA-4与CD28竞争B7，阻断T细胞受体信号，提高T细胞抗肿瘤特性[11]。程序性死亡蛋白1(Programmed death protein-1,PD-1)和CD28同源，表达于活性T淋巴细胞表面的另一种抑制性因子，同CTLA-4一样，PD-1上调可促进细胞凋亡。PD-1与配体PD-L1结合可活化T细胞效应，增强外周免疫。临床上成功运用CTLA-4、PD-1免疫治疗黑色素瘤[12，13]后，开始让研究者将免疫检查点的靶向治疗应用于OS。近来有研究证实PD-L1在OS细胞中表达，且PD-1/PD-L1结合能够增强细胞毒性T淋巴细胞活性[14]，研究人员在封闭K7M2骨肉瘤小鼠模型上的CTLA-4和PD-1抗原表位后，肿瘤特异性T细胞活性增强，产生对OS的有效抑制。随后再次将此OS细胞接种于该鼠，也能产生持久免疫能力[15]。针对免疫检查点的阻断是强化抗肿瘤治疗的有效方法之一，更多CTLA-4和PD-1免疫抑制剂正在研发当中。

1.2.3髓源抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)来源于骨髓组织，具有强大的免疫抑制作用。OS患者外周血MDSCs含量显著升高，Guan等人从外周血提取出MDSCs，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时定量PCR(Real-time PCR)、免疫印迹实验(Western blot)和流式细胞技术(Flow cytometry)证实MDSC与IL-18水平呈正相关。随后运用抗IL-18治疗，发现CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润加速，同时外周血及肿瘤细胞MDSCs含量显著降低，证实MDSCs能在IL-18诱导下迁移入肿瘤实质细胞[16]，抑制OS细胞生长。MDSCs与IL-18之间的相互作用机制仍需要进一步实验阐明，基于MDSCs与IL-18的相关性研究以及临床应用将成为骨肉瘤免疫治疗的有效策略之一。

2 抗OS靶向治疗

2.1抗骨肉瘤靶向治疗的分类 抗OS靶向治疗已不再是一个陌生的名词，经历数十年对骨肿瘤发病机制的不断探索，学者们发现若能够针对OS细胞不同部位特异性治疗，能够极大提高治疗效果，抗OS的靶向治疗应运而生。抗OS靶向大致可分为三个不同阶段：最初级的器官靶向治疗、细胞靶向治疗和特异性最强的分子靶向治疗。其中分子靶向治疗为目前研究热点，以前两阶段为基础，通过改变癌变基因，在分子水平阻断细胞传递通路，其作用靶点可以是某个蛋白质分子、某些DNA、RNA片段甚至基因产物。

2.2抗OS靶向治疗的最新进展

2.2.1核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)存在于骨组织中，与OS生成、存活有关。Beristain等[17]发现在转基因小鼠模型上，IgG2单克隆抗体地诺塞麦(Denosumab)能特异性结合RANKL，抑制OS细胞迁移和非停泊性生长。此研究成果为抗OS靶向治疗提供了重要理论依据。

2.2.2非转移性黑色素瘤糖蛋白B(Glycoprotein non-metastatic melanoma protein B,GPNMB)能促进OS分化，参与肿瘤转移过程。Roth等[18]获取67例骨肉瘤临床标本进行免疫组化检查，其中12例源于首诊患者，38例来自手术术后，17例为复发性OS，大于90%样本均表达GPNMB,且GPNMB蛋白水平与新型抗癌药物共轭物Glembatumumab介导的体外细胞毒性相关(r=-0.46,P=0.04)。此研究表明GPNMB通过影响Glembatumumab体内外毒性作用可杀伤OS。

2.2.3双神经节苷脂(Disialoganglioside，GD2)为含有唾液酸一种鞘酯类，有促进中枢神经系统再生的作用。GD2在正常组织中低表达，而在神经母细胞瘤中异常高表达，抗GD2治疗可显著改善高风险性神经母细胞瘤患者预后。Roth等发现几乎所有OS细胞中均过表达GD2，继续探究GD2对OS的抑制机制将会成为抗OS治疗的研究重点[19]。

2.2.4体内荧光蛋白成像技术是指在特殊激发光照射下显影表达荧光蛋白的肿瘤细胞，可观察肿瘤细胞产生、分化、凋亡全过程。Kiyuna等[20]运用该技术，在接种OS的小鼠体内植入巢蛋白调控驱动绿色荧光蛋白(Nestin regulatory element-driven green fluorescent protein,ND-GFP)蛋白，通过检测Gelfoam®指标来评价肿瘤新生血管情况。该试验发现不仅肿瘤新生血管均选择性表达GPF，并且证实鼠伤寒沙门氏菌A1-R能抑制Gelfoam®编码的肿瘤血管生成[20]。体内成像技术能直观反映肿瘤细胞与宿主免疫反应的相互作用及其生物学特性，为今后寻找更多抗OS治疗的靶点提供了新手段。

2.2.5雷公藤红素(Celastrol)为强氧化性的纯天然产物，能高效抑制蛋白酶活性诱发癌细胞凋亡。γδ T细胞既能识别癌细胞抗原，又能杀灭肿瘤干细胞，但杀伤作用不如自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)。李朝旭等[21]发现，雷公藤红素能通过上调OS表面死亡受体DR4与DR5，促进γδ T细胞对HOS细胞的杀伤作用。此研究体现了我国传统中医药对治疗OS的独特效果，其不良反应少，无骨髓毒性，对抑制肿瘤形成、防止和控制肿瘤转移有较大优势。

3 抗OS免疫靶向治疗

3.1抗OS免疫靶向治疗概念 靶向治疗可单独发挥抗肿瘤作用，靶向通路还能参与免疫反应中的激活、抑制、分化等过程，如增强DC抗原提呈及提高CTL的启动。抗OS免疫靶向治疗是指运用靶向制剂作用于OS特异性靶点，通过自身免疫调节，增强或抑制免疫应答，杀灭OS细胞。近年来有关免疫靶向治疗的研究层出不穷，BCR-ABL、EGFR、Her-2等靶点的发现及其免疫抑制剂的研发，已成为OS治疗重要里程碑，为OS的临床治疗，改善预后，提高患者治疗后生活质量提供了新方向。

3.2抗骨肉瘤免疫靶向治疗作用机制及最新研究进展

3.2.1增强抗原提呈作用 人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)和上皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)为酪氨酸激酶受体，与肿瘤增殖、侵袭、凋亡、转移、血管形成密切相关。Her-2及EGFR与相应配体结合后增强下游信号通路表达，降低肿瘤细胞黏附能力，增强抗原提呈作用，强化CD4+和CD8+T淋巴细胞活性，提高杀伤肿瘤细胞能力。最新研究显示，将嵌合人HER2/neu融合蛋白(ADXS31-164)的高度减毒重组李斯特菌疫苗作用于附肢OS狗模型，能高效诱导HER2/neu特异性T细胞应答，降低肿瘤复发率及生存率[22]，该研究结果对小儿OS治疗具有重大意义。

3.2.2调节T细胞增殖分化 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin,mTOR)为哺乳动物体内调节细胞生长代谢的激酶，雷帕霉素为mTOR抑制剂，能激活记忆性CD8+T淋巴细胞活性，增加效应性-记忆性CD8+T淋巴细胞分化，产生记忆应答，增强细胞毒活性[23]。PI3K/mTOR通路为OS特异性靶向通路，阻断PI3K/mTOR通路能抑制OS增殖、转移，促进细胞凋亡[24]，证据表明，PI3K/mTOR通路抑制剂NVP-BEZ235可诱导OS细胞自噬，增强顺铂对细胞抑制效应促进凋亡[25]。

3.2.3降低肿瘤免疫抑制 肿瘤细胞可产生免疫抑制，干扰T细胞抗肿瘤效能。内皮血管生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)异常高表达于肿瘤细胞，参与肿瘤细胞血管形成，具有强大的免疫抑制能力，能阻止体内最强抗原提呈细胞DC识别肿瘤特异性抗原，降低T细胞杀伤肿瘤能力。贝伐单抗能抑制DC成熟，明显降低VEGFA活性，增强T细胞免疫杀伤活性。贝伐单抗联合甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂可有效治疗局限性OS[26]，但会产生频繁伤口感染，其远期疗效仍需进一步研究。

3.2.4提高肿瘤细胞对免疫调节的灵敏度 肿瘤细胞抑制MHCⅠ类分子表达，干扰T细胞识别及免疫杀伤，并且增加抗凋亡蛋白表达减弱细胞毒作用。靶向制剂可干扰上述过程，提高肿瘤细胞对免疫调节的敏感性。PI3K-AKT信号通路调节肿瘤细胞增殖以及存活,而PI3K-AKT抑制剂能增强抗肿瘤的免疫杀伤作用。最近研究发现雌激素受体β(ERβ)通过PI3K-AKT途径获得调节OS增殖能力，并且ERβ激动剂能降低PI3K-AKT信号通路表达，发挥抗OS作用[27]。尚缺乏大量ERβ参与OS治疗相关的文献，此研究需进一步实验数据支持。

4 总结与展望

免疫反应联合靶向治疗为OS治疗提供了新平台，随着对抗肿瘤研究的不断发展，越来越多与OS相关的靶点被发现，免疫靶向药物不断产生，开创了OS治疗的新时代，探究免疫治疗与靶向治疗的协同作用将成为未来抗OS研究的新方向。mTOR抑制剂能促进记忆性T细胞分化，下调mTOR，控制肿瘤细胞的生长和血管生成。Her-2和EGFR与配体结合，增强抗原提呈作用，增强T细胞活性。ERβ激动剂阻止PI3K-AKT信号通路，调节肿瘤细胞增殖与存活。贝伐单抗联合其他免疫制剂，抑制DC成熟，更强的降低VEGFA活性，效果优于单用甲氨蝶呤。一些新方法虽效果显著，但仍处于试验阶段，并未完全推广到临床治疗当中。少数患者虽经系统治疗，远期效果并不理想，仍避免不了截肢，OS中晚期复发、转移机制尚不明确。所以，免疫靶向治疗仍然存在一些亟待解决的问题，如何提高局部给药浓度，如何降低药物副作用，如何降低耐药程度，国内外相关研究较少，尚需进一步探究。关于抗OS免疫靶向治疗更深层次研究，将会为临床治疗提供新的解决方案。