新药非临床安全药理学研究进展

郭健敏，许彦芳，马玉奎，胡晓敏，黄芳华，扈正桃，宫丽崑，姜德建，张立将，张雪峰，蔡 青，汤纳平，宗 英，苏筱琳，张文强，陆 兢，赵 斌，聂 昕，蒙飞彪，杨 威，王三龙，陆国才，汪巨峰

（1.广东莱恩医药研究院有限公司，广东 广州 510990；2.河北医科大学药理教研室，河北 石家庄，050017；3.山东省药学科学院新药评价中心，山东 济南 250100；4.国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022；5.成都华西海圻医药科技有限公司，四川 成都 610041；6.中国科学院上海药物研究所药物安全评价研究中心，上海 201203；7.湖南省药物安全评价研究中心，湖南 长沙 410331；8.浙江省医学科学院安全性评价研究中心，浙江 杭州 310053；9.江苏鼎泰药物研究股份有限公司，江苏 南京211800；10.康龙化成（北京）新药技术股份有限公司，北京 100176；11.上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 200120；12.苏州华测生物技术有限公司，江苏 苏州 215300；13.美国DSI公司，上海 201203；14.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，北京 100176）

安全药理学（safety pharmacology）作为新药研发的一个重要组成部分，主要是评价和预测药物在临床试验前的毒副作用，探讨药物剂量≥治疗剂量时，潜在的不期望出现的对生理功能的不良反应。通过不断出现的新技术和新方法进行自我更新，适应药物安全性评价的要求，其结果也会不断促进药物研发和安全性评价。对于各个系统和器官的安全药理评价并不是一个独立的过程。随着技术的革新，多个系统或器官可以在一个试验中同时进行评价。例如，遥测系统的发展使得一个安全药理试验既可以检测心血管功能，也可以检测呼吸系统功能，同时与摄像系统合用后还可以评价新药对部分中枢神经系统（central nervous system，CNS）的影响。由于新药的特点，有些安全药理实验不易或者不必独立进行，而是整合到毒理试验中，使从实验动物采集到的数据最大化，如生物技术药。但是与毒理实验的整合也要考虑实验设计和技术操作等因素。

目前，新药的安全药理学评价主要集中在非临床阶段，但需要将临床试验中出现的不良反应以及药物上市后人群出现的不良反应与非临床实验结果进行比对整合，这样以转化医学为背景的安全药理策略必然会促进药物研发，增强非临床安全药理数据的有效性，为药物研发的各个阶段的决定提供有力的证据。未来的安全药理学将依赖于药物的开发、科学和技术的进步及管理上的挑战。随着分子生物学和生物技术等的进步，新的药物作用靶点不断被发现。有些全新的靶点，应用当前技术可能或不能检测出有害效应的风险。故在药物的研发过程中，安全药理学面临新的挑战，是在用非临床研究模型评价新药时，如何研究和建立新的安全风险检测方法和手段，以识别可能对人类产生的安全风险。本文从指导原则到新技术、新方法，全面综述新药非临床安全药理学的研究进展。

1 安全药理学相关指导原则

美国、欧盟和日本，拥有较成熟和完善的药品监督体系和制药产业，该三方于1990年发起成立了ICH（International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use）。2015年10月，ICH全称更名为“International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use（国际人用药品注册技术协调会）”，其发布的技术指南已经成为国际药品注册领域的核心规则制订机制。

2017年6月，我国国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）成为ICH正式成员。2018年6月当选为ICH管理委员会成员。中国将逐步适应并于2020年5月1日起全面实施ICH的各级指导原则。

1.1 lCH对安全药理学研究的总体要求

安全药理学作为新药非临床安全性评价系统中一项重要组成部分，一直受到各国药品监督管理部门和新药研发人员的重视和关注。1997年7月，ICH发布了《M3：支持药物进行临床试验和上市的非临床安全性研究指导原则》和《S6：生物技术药物的非临床安全性评价》。ICH M3中指出，安全药理学研究包括对重要生命功能的评估，如心血管系统、CNS和呼吸系统。ICH S6提出，安全药理学研究应采用合适的动物模型，考察药物对生理功能潜在的非预期作用。M3和S6均要求，在非临床安全性评价中必须进行安全药理学研究，用于支持药物的人体临床研究[1-2]。

2000年11月，ICH正式发布了《S7A：人用药物安全药理学研究指导原则》。该指导原则统一和规范了安全药理学研究的定义、目的、试验设计、试验内容和相应的技术方法，在全世界范围内促进了新药安全药理学这一学科的形成和发展[3]。

2014年5月，CFDA紧跟国际前沿，基本参照ICH S7A要求，颁布了《药物安全药理学研究技术指导原则》，旨在进一步提升我国安全药理学的研究规范和技术要求[4]。

1.2 lCH对于非临床评价QT间期延长的特别要求

1.2.1 S7B

药物延长心电图QT间期引发心律失常，特别是致命性的尖端扭转性室性心动过速（Torsades de Pointes，TdP）的风险已被新药研发行业广泛认知。2005年5月，ICH正式颁布《S7B：人用药物延迟心室复极化（QT间期延长）潜在作用的非临床评价指导原则》[5]。该指导原则主要提供了关于药物QT间期的非临床研究及综合风险评估策略，制定心室复极化延迟和QT间期延长研究方案，是关于心脏非临床安全性评价的框架性指南。鉴于药物对快激活延迟整流钾电流〔IKr，其通道由human Ether-a-go-go related gene（hERG）编码〕的抑制作用是药物引发人QT间期延长的主要机制，所以S7B中体外试验主要推荐采用原代心肌细胞或表达hERG通道的人源细胞来评价药物对IKr的影响。同期，ICH还发布了与S7B相关的临床试验指南《E14：非抗心律失常药致QT/QTc间期延长及潜在致心律失常作用的临床评价指导原则》[6]，规范了在临床研究中如何确定新药的心脏安全性。S7B和E14中关于非临床和临床研究评价的结合，有助于促进人们对新药致心律失常的风险作出整体性的判断。

2014年5月，CFDA基本参照ICH S7B要求，颁布了《药物QT间期延长潜在作用非临床研究技术指导原则》[7]，保证了我国药品监管部门对安全药理学研究要求的国际一致性。

1.2.2 E14/S7B Q&A及其修订

近年来，以hERG钾通道阻断和QT/QTc延长为核心的评估策略逐渐暴露出其局限性。与此同时，借助各种电生理、分子生物学以及光成像等技术手段，人们对心律失常机制认识不断深入。为此，美国FDA在2014年提出了综合性离体致心律失常风险评估策略（Comprehensivein vitroProarrhythmia Assay，CiPA），推动了ICH E14/S7B的修订。新的CiPA主要根据药物对多通道的影响由计算机模拟系统预测致心律失常的风险高低。CiPA建议研究内容包括3部分：第1部分是在体外（可利用表达克隆的人各种离子通道蛋白的细胞系）评价药物对心肌Na+、K+（包括IKr，IKs和IK1）和Ca2+等多种离子通道的影响；第2部分是计算机模拟系统预测药物对上述各种通道的作用将如何影响心肌细胞动作电位（action potential，AP）；第3部分是在人源干细胞分化心肌细胞（human embryonic stem cells derived cardiomyocytes，hSC-CM）上验证药物对电生理的影响[8-10]。

2018年11月，ICH大会正式核准成立E14/S7B实施工作组（Implementation working group，IWG）来修订E14/S7B Q&A，其分别于2018年11月11-17日在美国夏洛特会议和2019年6月3-6日的荷兰阿姆斯特丹会议上，制定了相关技术文件草案。美国夏洛特会议主要内容为CiPA：计算机模拟技术、离子通道技术、数据的分析方法及标准化，细胞的来源、对照、参考化合物和人源干细胞在CiPA中的作用，人诱导多能心肌干细胞的方法学验证，及人体心肌细胞模型预测心律失常等。荷兰阿姆斯特丹会议主要内容：体外试验的回顾及试验方法、数据质量的一致性、心律失常模型、风险评估的Q&A及决策树、大分子药物进行QT研究的方法、E14风险评估的Q&A-低生物利用度/高心率药物的风险评估及综合分险评估等[8-9]。

根据ICH IWG会议精神，E14/S7B Q&A的具体内容将主要包括：①离体实验/数据收集、分析及解释规范；②S7B核心组合在体试验的考虑；③计算机模型、离体及在体试验等促心律失常模型的原理，以及在体实验设计的标准化及敏感性、浓度-QT分析；④结合S7B和E14进行综合风险评估的实例回顾；⑤对心律有影响的药物、不能进行TQT研究的抗肿瘤药物的要求；⑥大分子药物的考虑：确定不需要进行QT评估的“大分子”的阈值等；⑦心电图指标数据：临床和非临床生物学指标，回顾性、前瞻性分析，数据来源、分析与解释；⑧建立决策树等。ICH后续将进行征求意见的审议并修订E14/S7B的Q&A。修订工作具体分2个阶段完成：①阶段1：主要明确如何将体外（in vitro）、计算机模型（in silico）和体内（in vivo）试验标准化和应用的问答；并考虑这些推荐方法对临床评价的影响（当E14临床评价方法有疑问时），如临床QT评估受心率变化影响、临床不能检测超治疗浓度、无安慰剂组等。②阶段2：主要包括对S7B和E14创建预测算法或模型结果的Q&A，标准化的试验方法（计算机模型和体外人肌细胞研究中，提供实验条件、数据质量和报告标准），预测心律失常模型的指标，提供心电图和（或）不良事件数据的临床试验设计和解释信息，使用人心肌细胞评估药物的电生理效应，心律失常模型及心电图生物标志物数据，详细定义可能不需要QT重点临床评估的低/或无风险测试项目，并对需要额外数据的建议等方面进行确定。E14/S7B Q&A修订工作目前尚处于阶段1，计划2020年6月完成对阶段2讨论稿的审议，并确定最终Q&A的发布时间表[8-10]。

2 中枢神经系统安全药理学研究

2.1 体内外评价模型

近年来，随着对药物神经系统毒性的越发重视，CNS安全药理的早期筛查也越来越受到重视，其中以细胞培养/组织培养等实验方法为基础，利用生物化学、分子学、电生理学、形态学检验以及各种组学技术对毒物暴露致神经系统结构或功能损伤的体外评价系统得到了很好的发展。如细胞模型，除了常用的LUHMES和PC12细胞，诱导性多能干细胞近年来已被广泛用于神经疾病发病机制和神经发育毒性的研究，神经干细胞模型则能通过药物对神经干细胞体外生长发育指标的影响来评价其可能存在的神经毒性等[11-14]。

ICH S7A要求的哺乳动物体内CNS评价测试方法主要包括Irwin或功能观察组合（functional observational bakery，FOB）实验，一般以小鼠或大鼠为测试系统。随着近年来生物技术药物持续的研发热潮，非人灵长类动物作为许多抗体或蛋白类药物的药理相关实验动物种属，是非临床安全性评价中的重要实验动物，对于猴为唯一药理学相关种属的药物，猴FOB实验在评价药物对CNS的潜在作用时具有重要意义。Gauvin等[11]于2008年报道了猴FOB试验方法，至今多个国际和国内合同研究组织（contract research organization，CRO）在其基础上建立了自己的猴FOB实验系统。由于非人灵长类动物的药效或毒性反应易受到社会变量的影响，为此群居条件下所获得的数据更为接近人类精神神经行为和疾病过程。而应用视频跟踪系统获得图像后定量分析神经系统指标变化，将获得更为准确的评估结果，为此是否能利用人工智能学习技术进一步发展对试验中的视频结果（如动物行为学变化，甚至是面部特征变化）进行记录和评价等成为该领域的拓展方向。

2.2 计算毒理学与人工智能技术在综合评估的应用

“21世纪毒性测试和风险评估的愿景”旨在通过定量的体外到体内外推（quantitativein vitroin vivoextrapolation，QIVIVE）增加人类相关体外模型系统的使用[15]，以减少、完善并最终取代动物模型的使用。在20世纪之初，神经网络模型已被报道用于化合物神经系统毒性的高通量早期筛查，随后越来越多的计算模型被应用到安全风险的预测和评估中，得到快速发展和应用。用建模和仿真来实现毒理评估的转化，能够观察到这些毒性效应的相关浓度从体外到体内的情况。例如，分布生物动力学建模可以从体外细胞测定系统中测试化合物的合成，可以预测游离培养基的浓度和细胞内浓度。相应的理化性质（如logPow、pKa和溶解度）和化合物设立体外测定的条件（如细胞类型、细胞数和培养基组成），均被认为是与推动体外到体内定量的转化毒理学终点密切相关。基于全身的生理学药代/生理学毒代动力学（physiologically based pharmacokinetic/physiologically based toxicokinetic，PBPK/PBTK）建模和仿真是可以预测人体对化合物的全身和组织暴露的非临床动物模型。因此，PBPK/PBTK模型不仅可以告知体外毒代动力学到体内的转化，也有助于从动物到人类的种属间的转化。整合这2个模型方法，体外确定的有效浓度可以被校正为与体内相关的驱动浓度，然后，通过反向剂量法将其转换为人等效剂量下的血浆浓度或目标组织浓度，通过模拟可以预测被鉴定为有害的体外PBTK模型。Bal-Price等[15-16]应用不良结局路径（adverse outcome pathway，AOP）概念，对已知对于CNS和周围神经系统的正常功能至关重要的多种细胞和分子过程进行了总结，由于CNS和周围神经系统的生物学和功能复杂性，在化学暴露导致神经系统不良结局的途径之间建立起因果关系和定量关系一直具有挑战，而这种作用机制明确的综合测试和评估方法（IATA）可能具有开发前景。

2.3 核心组合安全药理实验

CNS核心组合实验是一些常规的标准化的快速测试，这些测试通常也可在药物研发的早期阶段被用于测试先导化合物是否有潜在的CNS风险。这类早期测试通常在大鼠上进行。ICH S7A主要建议的核心组合实验包括临床观察、自发活动和运动协调。日本指导原则的第一级研究中除了S7A的建议外，还包括了惊厥阈值、与安眠药的相互作用和疼痛阈值的测定。ICH SA7中建议这类核心组合实验均应参照药物非临床研究质量管理规范（Good Laboratory Practice，GLP）法规执行。

实际上，类似Irwin和FOB实验这种利用标准化方式对药物进行系统地观察的方法原则上可以使用于其他动物种类（甚至可以用于人）。而ICH S7A中也提到可以使用功能组合实验作为CNS核心组合实验[17-18]。

2.4 补充和追加安全药理实验

这类研究的范围涉及更广泛，通常会涵盖认知功能（学习、记忆和注意力）、脑电图（electroencephalogram，EEG）和药物依赖/滥用测试。由于这类研究的复杂性，目前还无法将其标准化，故未要求其必须遵循GLP，但必须按照国际公认的科学的方法进行。

2.5 EEG研究

电生理学范围广泛，涵盖从体外研究如细胞内和细胞外到整个动物的体内研究如EEG。EEG研究本身是一个非常宽泛的概念，涉及到大脑电活动的各个方面，从头盖骨外的表层记录到脑内的深度电极记录（自发性生物电位）。而作为追加的CNS安全药理研究，EEG研究主要涉及清醒自由活动动物的定量EEG（quantitative EEG，qEEG）和睡眠/觉醒周期[19]。

2.6 评价新技术

脑成像、神经递质监测和脑电监测等方面的新技术在近20年来被广泛地运用于脑科学研究中。比如脑电监测是一个长期持续性的过程，从24 h到几周，并且需要避免在测试过程中引入麻醉剂、应激反应等干扰因素，故植入式遥测技术在CNS研究中有着天然的技术优势——即使用清醒自由活动的动物进行长期监测。遥测技术已被广泛地应用于基础脑电研究、睡眠研究和癫痫研究，辅助研究者做出了许多高质量创新研究，并取得了重大成果。

此外，还可以将遥测系统和视频监测系统与动物行为学系统联合使用。例如，通过优化手术方法，联合视频技术，建立了可长期连续监测清醒自由活动大鼠大脑皮质、海马EEG、肌电图和行为活动度的动物模型。该模型首次将遥控监测动物脑电图技术和视频技术（video-telemetric electroencephalography，Video-tEEG）结合起来，同步研究药物对动物行为活动和EEG的影响，且动物可在清醒自由活动状态下被长期连续监测，这为CNS药理学和新化合物安全性评价提供了一个新的强有力的动物模型。

未来CNS安全药理学的研究趋势主要可体现以下几个方面：①FOB实验的不断完善和标准化：与人类一样，动物也具有社会行为，群养的动物间会形成从属关系，不同阶级的成员之间会表现出不同的社交行为。与自然界不同的是，对于在实验室条件下饲养的动物，一般以单性别为1个群体，动物的社会行为会发生改变。因而，在FOB实验的笼内观察中，不再只是单纯检查动物的一般生理状态，更应该关注药物对于动物行为学的影响，并增加相应的观察和描述标准，如社会行为包括玩耍、顺从、威胁和攻击。另外，随着社会行为视频分析手段的不断发展，大小鼠步态分析系统、视频追踪、射频识别（radio frequency identification，RFID）和行为学自动分析软件的应用能更好地满足行为学观察的时间要求和指标量化，对于社会行为的描述变得更加客观。同时FOB实验观察指标、评价标准和统计方法也逐渐统一。未来也会有更多的实验动物例如食蟹猴、Beagle犬等FOB模型越来越完善，更多的应用于中枢神经系统核心组合实验中来。②CNS追加的安全药理学实验技术会越来越成熟，高架十字迷宫、长时程增强效应测定及动物EEG测定等实验技术也将会更多地用于行为、学习记忆、神经生化、视觉、听觉和（或）电生理等指标的检测。③随着近年来神经生理、神经生化、神经内分泌等研究的不断深入，新的神经毒性生物标志物如髓鞘碱性蛋白等也会逐渐应用到药物对神经系统的影响中[11-19]。

3 心血管系统安全药理学研究

3.1 心脏安全药理学评价新技术

鉴于国际上心血管安全药理方面的发展方向，正朝着新策略CiPA的方向努力。且从新药评价技术的发展趋势看，体外综合评价技术，在未来的新药评价中最终将占据主导地位。

3.1.1 体外离子通道研究

在新药早期筛选阶段，首先要进行体外hERG电流实验。然而参与心肌动作电位复极有多种外向和内向电流。一方面，并非所有药物引发的心律失常都来自阻断hERG通道；另一方面，药物可能同时影响多种离子通道，对其他通道的作用将改变hERG钾通道阻断带来的风险程度，如同时抑制晚Na+电流的失活将增加风险，而同时抑制晚Na+电流或L型Ca2+电流将降低风险。据报道，大约60%具有潜在治疗作用的新化合物由于明显的hERG阻断，在早期阶段停止研发，而这些化合物不一定具有致心律失常风险。因此，新的CiPA策略要求检测对多种离子通道的影响，CFDA颁布的《药物QT间期延长潜在作用非临床研究技术指导原则》亦做出同样的要求。主要采用原代心肌细胞或异源表达细胞系评价药物对 IKr/hERG，IKs，Ito，INa（包括晚Na+）和ICa-L等的影响[4，7]。

3.1.2 计算机模拟技术

计算机模拟毒理学，主要是通过建立定量结构活性关系计算机模型（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型来预测、阐明化学物质的毒副作用及作用机制。在心脏方面的安全性评价中，可通过计算机模拟模型，利用药物对多个离子通道的影响来预测药物对动作电位的影响及致TdP的风险。美国FDA正在致力于促进用于心脏安全性评价的可靠且经过验证的计算机模型的发展[10，20]。

3.1.3 人源干细胞分化心肌细胞技术及应用

人源干细胞（包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞）分化心肌细胞技术的出现使药物敏感心律失常细胞模型的建立得以实现。研究表明，尽管hSCCM为不成熟的心肌细胞，这些细胞具有对药物反应比较敏感、无种属差别、急性或慢性孵育、高通量测定等优势，特别是诱导多能干细胞分化的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CM）无伦理问题，患者来源hiPSC-CM携带疾病特有的遗传突变特征，为心律失常机制研究广为采用。在体外培养的单层hSC-CM上可直接观察到药物诱发早后除极和触发电活动，为评价药物潜在致心律失常风险提供了良好的细胞模型。CiPA工作组成立以来的5年多时间不断发布相关的工作进展（https：//cipaproject.org/about-cipa/），以28种临床验证的高、中、低3类风险致心律失常药物为验证药物，系统研究了其对各种离子通道的影响、比较了其对多中心不同来源hiPSC-CM和不同记录方式下（微电极阵列场电位记录、电压敏感染料记录AP）的电生理影响。相信不久的将来CiPA工作组将建立起药物对hiPS-CM电生理终点评价参数的实验规范流程及系统验证方案[10]。hiPS-CM实际应用的主要挑战是其不成熟性，不同来源以及不同的诱导分化、培养条件等造成细胞电生理的差异性，目前对国内研发的hiPS-CM尚无系统的实验验证资料。

除评价药物致心律失常风险外，hiPS-CM还用于检测药物导致的心肌细胞损伤。已经报道多种中、高通量商业化技术平台测定药物对hiPS-CM的收缩影响，包括基于视频分析、Ca2+内流、细胞阻抗分析等不同原理设计的实验平台。除测定收缩外，还可测定细胞存活率、线粒体膜电位、Ca2+瞬变和细胞膜通透性等多种参数，从而全面评价药物的潜在心脏毒性风险。细胞微电子芯片技术是基于检测电子传感器阻抗变化以反映细胞生理状态的新型实时心肌细胞分析系统，其系统的核心是把微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞检测板的底部或细胞浸润迁移板的微孔膜。微电子芯片主要通过测定电阻抗来反映细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁程度等一系列生理状态。实时心肌细胞分析系统所具备的实时数据采集、搏动周期的短期和长期检测优势及系统的高通量，使这一技术非常适用于候选药物和各种材料的非临床心脏安全性评估。目前，该系统已经广泛用于心肌细胞搏动、收缩和场电位等方面的研究[21-25]。

3.2 清醒动物遥测技术

目前主要有2种遥测技术：马甲式遥测系统（Jacketed External Telemetry，JET）和全植入式遥测系统（Implanted Telemetry）。JET系统接收动物的实验数据主要检测ECG和体表温度，目前多用于毒理实验中的安全药理数据采集；全植入式遥测实验可以同时监测ECG、血压、体温、心收缩力和血液学指标等等。通过遥测技术可以采集到心率和ECG相关指标，如QRS间期、QT间期、ST段和PR间期等。由于PR间期和QT间期容易受到心率、样本量、噪声等的影响，根据实验设计和应用的动物种属以及数据质量的不同，应该选取合适的公式进行校准。一般来说，常见的校准公式有Van de Water公式、Fridericia公式和Bazett公式等。具体使用哪个公式和校准方法，还是需要根据具体的数据样本和质量来确定。

植入血压主要分2种：微创血压（minimum invasive blood pressure，MIBP）和全植入血压（implanted blood pressure）。全植入血压是全植入的遥测系统中的一部分，主要可以测量股动脉压或者腹主动脉压，以及左心室压。左心室压力的检测不仅可以反映血压的变化而且还可以间接反映左心室肌收缩力的情况。因此，全植入血压可以较为完整地评价心血管系统中的血压和心收缩力的状况。

MIBP植入技术是针对JET系统不能监测血压而研究设计的。JET系统主要用来监测ECG和体表温度而不能监测血压等重要的心血管功能指标。最近出现的MIBP植入技术使JET不仅能够监测ECG和体表温度，而且可以监测药物是否对血压造成影响。MIBP植入技术是指通过手术将监测血压的植入子插入动物的一侧股动脉中或者腹主动脉（如果加长导管）中，然后再将植入子的头部即发射器部分缝合在皮下肌肉中。这样血压信号就可以通过导管传入植入子的发射器内，再通过信号转换将血压信号转换成无线电信号并通过接收器传入采集的电脑中。这种技术既弥补了JET系统不能采集血压数据的缺陷，同时它与JET系统结合在一起能够采集较为完整的心血管方面的安全药理数据。这对将安全药理整合到毒理实验中的实验方式有着重要的意义[22，26]。

3.3 心血管安全药理追加实验

①血流动力学检测：对比格犬、食蟹猴和巴马猪的血流动力学检测方法进行优化，提出行业规范化意见。促进血流动力学实验在相关药物评价中的应用，全面评估药物对心血管系统的作用特点。②规范并推广离体血管肌张力实验和微血管肌张力实验在新药评价中的应用，开展药物对血管直接作用的评价能力建设。③离体心脏模型可以直接评价药物对心电和心肌收缩力等的综合作用，当前在众多实验室中均有应用[22，26-27]。

4 呼吸系统安全药理学研究

4.1 呼吸功能评价

目前，非临床安全性评价多采用清醒动物无创的方式进行呼吸功能检测。通过无线遥测技术检测实验动物在清醒状态下各项呼吸参数，不受麻醉药物的干扰，所得数据更为真实。

常用方法包括体积描记和全身体积描记，其优点是操作简便，缺点是检测指标单一且数据易受动物活动和环境的影响。另外，由于动物驯化机制不完善，应激反应导致不同研究机构获得的数据差异大、重复性差。因此，无创方式一般用于核心组合实验及快速筛选。有创方式包括呼吸电极植入子及麻醉状态下的气管插管术，前者可以在清醒无干扰的情况下测量动物的呼吸但检测指标单一，后者检测指标丰富、灵敏度高但麻醉药剂量及时间对呼吸功能的影响较难把握[28-29]。

近年来，随着肺功能检测手段的不断进步，用于临床呼吸系统功能检测的强迫振荡肺功能测定技术（forced oscillation technique，FOT）也逐步应用于非临床评价过程。FOT技术是将工程学强迫振荡技术用于呼吸力学方面的测定，2007年欧洲呼吸协会提出了针对强迫振荡技术临床应用的技术规范，标志着该技术走向成熟期[30]。FOT技术使得气道阻力及肺顺应性的改变易于检测，从而提高了药物对呼吸系统毒性检测的灵敏度。且FOT设备本身可作为呼吸机进行机械通气，帮助实验人员实施开胸术测量肺动脉压，同时结合血气检测，可以获得较为完整的呼吸系统追加实验数据。总之，通过该技术，可以在吸入药物评价、肺纤维化模型、气道高反应性及肺动脉压等检测上获得灵敏度高、一致性好、重复性佳的数据。

全身体积描记法由于对动物无束缚，其数据的稳定性上具有很大的优势。除了常用的检测指标，如潮气量、呼吸频率和每分通气量外，还可以检测包括吸气和呼气时间，吸气和呼吸时的峰流量，呼吸暂停时间（apneic time）和呼吸暂停计数和气道缩窄指数（enhanced pause，Penh）等。全植入式的呼吸遥测技术是将电极埋置在胸廓相应位置，在动物呼吸运动时，胸廓的体积变化引起不同电极间的电势发生改变，从而演算得到呼吸波形，经过校准后，同样可以测量主要呼吸参数，且只需要定期进行校准，和马甲式遥测技术相比，手术恢复后的动物适应性更好。不过该方法需要手术且对电极的埋置位置的精确度要求较高，在操作上具有一定难度[28，31-34]。

近年来，随着新版《药物安全药理学评价研究技术指导原则》的颁布，使用清醒动物进行遥测实验已是大势所趋。目前，国内多数实验室已能实现生物信号遥测系统在实验动物清醒状态下检测其自由活动的多种生理指标的变化，且准确性得到大幅提升，但获得的指标仍仅限于呼吸频率及呼吸幅度，并未对呼吸深度进行量化，且不能全面反映动物肺功能和气道的反应性情况。近年来，随着药物非临床研究质量管理规范在我国的严格执行，安全药理学的研究发展也异常迅速，呼吸系统指标的检测手段也在不断进步。

4.2 肺功能检测指标

目前动物实验性呼吸系统功能研究中，常用测量指标包括潮气量、呼吸频率、气道阻力、肺顺应性、肺动脉压力、呼气容积、呼气流速和弥散系数等，通过不同的指标反映呼吸系统功能的变化。例如，在实验性动物哮喘实验中，主要对动物的胸内压、气道流速、潮气量、气道阻力和肺顺应性等进行研究。动物的胸内压一般通过麻醉动物胸腔插管的方式，将带有压力传感器的压力探针刺入动物胸腔，通过压力探针获得动物的胸内压。气道流速一般是通过气管插管的方式获取，在动物麻醉过程中通过动物手术将流速传感器插入动物的气管，通过流速传感器获得动物的气道流速。潮气量一般是通过封闭体积描记箱技术，把动物放置在密封体描箱中，动物胸腔的变化对体描箱空气会产生挤压效果，通过对箱体内气体的压力或流速进行分析，即可得到动物的潮气量。根据动物的呼吸状态进行分类，又可分为自由呼吸和强制呼吸两种。其中自由呼吸是指动物在自主呼吸情况下测得的肺功能指标，强制呼吸是指动物在麻醉接上呼吸机的情况下测得的肺功能指标，前者一般测得的是动态肺顺应性，后者测得的是静态肺顺应性[32-33，35-36]。

5 补充安全药理学研究

5.1 胃肠道系统

体内实验的检测指标主要包括胃排空和肠道推进、胃液分泌、胃蛋白酶活性等，胃排空和肠推进实验中所用的指示剂种类繁多，如5%活性碳粉、半固体营养指示剂（明胶、羧甲纤维素钠、糖、淀粉和着色剂等）、酚红或伊文思蓝溶液。其中半固体营养指示剂在胃肠道内运动相对较慢，可适用于有促进胃肠道运动作用的药物评价。酚红或伊文思蓝溶液较适用于非禁食状态下的胃排空实验，以排除食物对实验结果的影响。另外，[13C]辛酸呼吸法同样可检测胃排空功能，此方法是一种非侵入式的检测方法，排除了麻醉，生理应激状态对胃动力的影响。除此之外，还有报道用清醒自由活动动物模型进行胃肠慢波监测，并测试给药后的药物反应[37-40]。

86 动脉瘤性蛛网膜下隙出血后脑血管痉挛的诊断和治疗进展 陈荣彬，吴学铭，赵 亮，韩凯伟，黄承光，于明琨，侯立军

未来胃肠道补充安全药理学的研究趋势主要可体现以下几个方面：①发现并验证能够诊断胃肠道损伤的特异性好、灵敏度高的生物标志物会成为胃肠道系统补充的安全药理学研究的重要发展方向。例如，瓜氨酸有可能作为分析小肠吸收功能的生物标志物等。另外，胃泌素、胃动素、胆囊收缩素、生长抑素、血管活性多肽、促胰液素以及P物质等胃肠激素水平可反映胃肠功能情况。②胃肠道功能新的检测技术方法应用，包括超声诊断、放射学、核素显像、核磁共振、胃肠电图、生物电阻抗、胶囊内镜和腔内测压等。尽管这些方法已在临床应用，作为临床诊断胃肠功能的客观手段，但是动物试验中应用较少。未来可针对实验动物开发不同的检测仪器和诊断标准，用于实验动物胃肠道功能的测定[38-40]。

5.2 泌尿系统

药源性肾损伤是肾毒理学研究的重要内容，并且评估药物对肾功能的影响也是药物非临床评价安全药理学的研究内容之一。体内实验的检测指标可包括排尿量、比重、渗透压、pH、尿液电解质、尿蛋白质、肌酐排泄量和肾小球滤过率（菊粉）。对肾损伤近年来研究热点主要集中在早期损伤标志物的探索，如尿N-乙酰-B-氨基葡萄糖苷酶、血清胱抑素、肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）和β2微球蛋白等。

此外，由于物种间肾药物转运体和代谢酶的表达和功能差异，动物实验和人临床试验数据结果之间常常出现不一致的情况。因此，人类肾体外模型作为整体实验的重要补充，得以广泛应用。这些体外模型能够在新药研发早期进行较高通量的筛选，更为经济和高效。目前使用的体外肾毒理学研究方法主要有离体肾灌流、离体肾单位灌流、肾组织切片、离体肾小球和肾小管节段模型、体外细胞模型及芯片肾（kidney-on-a-chip）等。近些年，诸如毒理基因组学和3D细胞培养等新技术的提出，也为体外模型的研究和应用开辟了新的方向。对于肾泌尿功能的检测主要通过尿液分析和基于血清的参数的测量来评估，包括肾排泄功能、电解质和代谢物等常规检测指标。这项研究需要让动物在有温控的代谢笼中收集尿液。在预定的时间间隔内，收集尿液用于尿量、电解质、尿生化指标以及代谢物的分析。此外，近期研究发现较为敏感和稳定的尿液肾损伤的标志物可用于肾功能指标的检测，如Kim-1等蛋白类生物标志物以及微RNA等核酸类生物标志物。这些检测方法和指标的发现为提高非临床肾泌尿功能损伤的检测和筛选提供了支持[41-43]。

5.2.1 诱导多能干细胞来源的人肾近曲小管细胞样细胞

近年来，利用干细胞技术，将胚胎干细胞或用诱导性多能干细胞技术诱导分化产生肾近端小管细胞用于体外肾毒理学研究，也展现出了良好前景[44]。

5.2.2 芯片肾

基于微芯片制作技术和微流控技术的芯片肾，构建了体外的肾仿生环境，为研究药物对肾功能的影响和损伤作用提供了崭新的平台。芯片肾的大小约2 cm2，芯片用微通道模仿了肾单位的近端小管到远端小管部分，在体外重现了肾的滤过作用和重吸收作用。微通道内多种细胞共培养，包括肾上皮细胞、足细胞和血管内皮细胞等，均是基本的肾单位细胞类型，借助微流控技术模拟肾中的灌注，不仅可用来研究药物的肾毒性，还可以通过与其他组织类型的模型连接，研究药物暴露后的组织间的相互作用[45]。

5.3 血液系统

药物对血液系统影响的研究目前主要是基于外周血细胞计数以及血涂片和骨髓涂片等形态学检测来进行研究，而对于细胞功能方面的研究相对较少。对于红细胞功能，目前应用较为广泛且便捷的方法是采用血气分析仪检测血液中pH、二氧化碳饱和度以及氧气饱和度，进而对红细胞携氧功能进行检测。对于血小板功能，主要涉及血小板黏附功能检测、血小板聚集功能检测以及血小板释放功能检测。这些检测方法也主要是在临床血小板功能的检测方法的基础上进行了改良和验证。近年来，国内外对血小板聚集功能方法研究开发比较活跃，这与血小板聚集功能在血栓形成过程中的作用密切相关，也因此受到国内外研究者的广泛关注[46]。

5.4 肝胆系统

药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）的危害性受到越来越多研究者的关注，亟需合适的体内外DILI模型，为新药的研发、筛选、DILI的发病机制以及药物发挥药效的机制研究提供条件。目前可以模拟DILI的模型包括体外和体内模型，它们各有利弊，从不同的层面为DILI的研究提供基础。DILI的体外研究模型分别介绍如下。

5.4.1 亚细胞水平模型

肝微粒体是从肝组织匀浆后得到内质网碎片所形成的小型囊泡，富含各种肝药酶，代表肝中一个酶系统。它可以代谢各种化学药、中草药等各种异物小分子，代表肝代谢能力的亚细胞单位。药物通过与肝微粒体共孵育（47），结合体外细胞学实验，可为IDILI的体外研究提供一定的方法。

5.4.2 单层细胞培养模型

单层培养，或可称为2D平面培养，是指将肝细胞种到预先铺有细胞外基质如胶原、纤连蛋白或人工基底膜等平面上进行培养。单层培养的肝细胞一般都能保持肝功能几小时到几天。然而，单层细胞培养模型去分化现象严重，肝药酶代谢能力容易变弱或消失，功能蛋白表达不完整，只适用于较短期内初步筛选可能导致肝损伤的药物[48]。常用于单层细胞培养模型的细胞有原代肝细胞、L-02细胞系和HepG2细胞系等。

5.4.3 三明治培养模型

三明治培养，介于2D培养和复杂的3D培养之间，肝细胞被夹在2层基质膜如胶原蛋白或人工基底膜之间，可以长时间（可达数周）维持细胞活力、形态以及药物代谢酶功能，尤其在无血清培养基中会有更多的胆小管结构形成，是研究胆汁淤积型肝损伤较好的体外模型[49-51]。但是，肝特异性的功能基因表达随时间延长而减弱，肝细胞去分化过程不能克服。

5.4.4 3D培养模型

3D培养模型可以更加接近体内肝模型，目前，研究人员研发出了一系列3D肝细胞培养模型，且肝细胞的种类不局限于人源肝细胞和原代肝细胞。如3D多细胞球体模型，将细胞重悬在液体基质（水凝胶）中进一步聚合或采用悬浮滴注技术产生多细胞球体，球体直径一般在50～100 μm。由原代肝细胞所形成的球体模型长时间维持细胞活力和形态，适用于慢性蓄积性致肝损伤药物体外筛选的研究[52]。

5.4.5 肝芯片体外模型

人体器官芯片（human organs-on-chips）是一种可以在芯片上构建的器官生理微系统的技术，是近几年快速发展起来的一门前沿科学技术。通过微流控芯片技术、细胞生物学、生物材料和工程学等多种方法手段的结合，在体外模拟构建含有多种活体细胞、功能组合界面、生物流体和机械刺激等复杂因素的组织器官微环境，更加真实地反映人体组织器官的主要结构和功能特征[52-53]。

近年来，研究者已成功构建人工肝窦芯片，通过高渗透性的内皮间隙结构将原代肝细胞与外部血窦样区域分离，在保持肝特异性功能的同时，最大程度上接近人体内的真实形态[51]。也有研究显示，在构建肝芯片模型时，将成纤维细胞、肝星形细胞以及人诱导性多能干细胞来源的血管内皮细胞等其他细胞及流体因素参与考虑其中，可以促进肝细胞发育、白蛋白分泌、糖原合成及药物代谢等肝功能的发挥[52-53]。

6 体外安全药理学展望

体外安全药理学研究在药物的早期研发中也具有极其重要的意义，其研究内容包括化合物对受体、酶、转运体以及离子通道的作用。通过将体外安全药理学研究和传统安全药理学研究结合起来，对临床后期开发成功率已经显示出了积极影响，而在药物发现过程中，开展体外安全药理学研究也能够产生显著影响，包括：①在先导化合物的合成/选择阶段鉴定出安全风险并辅助决策；②在先导化合物的优化阶段指导降低安全风险；③在先导化合物优化的末期阶段，结合已经获得的治疗剂量下血药浓度，评估该暴露量下的安全风险并辅助确定候选化合物；④在非临床和临床开发阶段协助风险管理。

体外安全药理学的早期研究范围主要集中在与药物靶点密切相关的少数几个蛋白种类，随着科技水平和筛选技术的提高，这个范围逐渐覆盖到了涉及重要生理系统（心血管、呼吸以及中枢神经）的多个蛋白种类，具体蛋白种类的确定，是以存在不良反应的上市药物为分析目标，通过研究这些药物对不良反应关联靶点蛋白的作用，从而确证哪些蛋白具备安全预测能力。基于阿斯利康、葛兰素史克、辉瑞以及诺华四家跨国制药企业的相关数据，一个最小筛选组合已经被确认，这个组合中的蛋白大部分源自G蛋白偶联受体超家族，包括了12个亚家族中的24个蛋白，此外还有7个离子通道相关蛋白、6个胞内酶类蛋白、3个神经递质转运体蛋白、2个核内激素受体蛋白以及1个激酶蛋白，这44个蛋白被推荐作为化合物的体外安全药理学早期评价组合。筛选采用的实验方法主要包含配体结合试验和功能评价实验，通常情况下，这2类实验会先后进行，从而形成互补以避免错误判断。截至目前，已经有一些制药公司中的实际案例，显示早期体外安全药理学研究结果直接影响甚至改变了药物开发历程[54-56]。

从上述内容可以看出，体外安全药理学研究方向可以大致分为2个，一个是以ICH指导原则为主的标准化研究，以hERG通道试验和未来可能要推行的CiPA方案为代表；另一个则是制药公司主导的在新药早期开发阶段进行的筛选研究。其中前者将按照规划稳步推行，后者则处于相对灵活的情形，直到相关经验累积成熟至形成共识。逐渐在新药发现阶段开始加入体外安全药理学研究，并根据实践经验逐渐形成体系。体外安全药理学的参与程度必将越来越高。

安全药理学在新药研发和管理药物批准过程中，它是一个被重新引起重视的学科，当代安全药理学具有了全新的内容和研究范围。它被认为是整个药物安全性评价的重要组成项目之一，是为病理学、生物化学和毒理学评价提供补充的关键项目，是制药工业在药物研发中对药物安全的一个新认识。