马梨形虫病及其诊断方法概述

刘 铮，张义伟，李茜茜，桑晓宇，冯 颖，姜 宁

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866）

马梨形虫病（equine piroplasmosis，EP）是一种由梨形虫寄生于马属动物的红细胞中，引发马属动物发生一系列临床症状甚至死亡的血液原虫病。本病的主要临床特点是急性溶血性贫血，其他特点包括高热、呼吸困难和黄疸等[1-4]。急性感染时，极易造成感染马匹死亡。

由于感染该病并治愈的患病马匹在临床上具有明显的带虫免疫特症，可在很长一段时间内表现出对马梨形虫病具有较高的抗性，并且在媒介动物再次叮咬后不再表现明显的临床症状，因此会造成马匹饲主对该病的忽视。一旦有新出生马匹或外来马匹引入该地区时，则极易发生急性感染，严重时患畜可能直接死亡，从而对该产业造成极大的经济损失。本文对马梨形虫病的病原生活史、流行病学特征、临床症状及诊断方法等方面进行了简要概述与总结，以期为马梨形虫病诊断、流行病学调查和预防布控提供支持。

1 马梨形虫病概述

马梨形虫病的病原体包括顶复亚门（Apicomplexa）孢子虫纲（Sporozoasida）梨形虫亚纲（Piroplasmasina）的巴贝斯虫科（Babesiidae）的驽巴贝斯虫（Babesia caballi，B. caballi）和归属于泰勒虫科（Theileriidae）的马泰勒虫（Theileria equi，T. equi）。这两种虫体主要靠中间宿主“硬蜱”的叮咬在马属动物间传播[5-8]。

1.1 生活史及传播途径

梨形虫具有特定的生活史。在自然条件下，梨形虫需要通过终末宿主硬蜱进行传播，其主要传播途径有两种：其一是利用蜱卵进行传播，梨形虫在雌蜱吸食马属动物的血液时进入雌蜱的体内进行繁殖发育，在繁殖后期进入雌蜱的卵巢，通过蜱卵传给雌蜱的后代，而后在蜱的后代吸血时随着唾液的分泌，进入中间宿主马属动物的体内；其二是期间传播，以T.equi 为代表，当幼蜱或若蜱吸食感染T. equi 的马属动物血液，并长成为若蜱或成蜱时，可继续通过吸食马属动物的血液进行传播[9]。

1.2 流行分布

本病分布范围广泛，世界范围内均有报道。主要分布在热带、亚热带地区，巴西、南非、土耳其等国均出现过相关病例[10]；我国的新疆、吉林、广东等地也有很多关于本病的相关报道[11-13]。本病流行具有很明显的季节性。在我国，革蜱多于春季2 月大量出现。随着3 月和4 月气温升高，蜱虫的活动也开始频繁，马梨形虫病的病例也逐渐增多，而5 月份之后，随着蜱虫活动能力的下降，马梨形虫病的流行也渐渐停止[14]。

1.3 易感动物及传染源

马、驴、斑马等马属动物均为马梨形虫病的易感动物，其中幼年动物具有较弱的抗性并且缺乏马梨形虫病的特异性抗体，因此更易受感染。蜱虫作为马梨形虫病的传播媒介，在该病的流行中有着十分重要的作用。蜱虫种类众多并且分布范围较广，其中4 个品种的蜱虫可在马梨形虫病发病高峰时期进行传播，9 个品种的蜱虫可在排卵时期传播B. caballi，9 个品种的蜱虫可在马梨形虫病高发时期传播T. equi[15]。

2 马梨形虫病诊断方法

2.1 病原形态学诊断

马梨形虫寄生于哺乳动物红细胞内具有多种形态，如圆形、梨形、棒状等，同种梨形虫不同形态的虫体常同时寄生于同一红细胞内[16]。但就一种虫体而言，总会有一种或几种较为常见的特有形态，被称为该虫体的典型形态。

目前可用于检测马属动物梨形虫病的病原学诊断方法包括，血液涂片染色镜检、淋巴组织穿刺检测、淋巴结组织切片检查法等[17]。其中，血液涂片染色方法作为检测各种血液寄生虫病急性感染最快捷的方法，相对于其他检测手段，在临床上使用更为广泛。

虽然本方法在临床上可以对急性病例进行快速诊断，但在对大量临床样本进行检测时操作较为困难。同时，染色剂的质量、血液涂片的制作效果等人为因素也会影响到最终的检测效果。因此，在待检动物的染虫率较低时，本方法诊断准确性存在明显不足[18]。

2.2 免疫学诊断

2.2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA 技术在马梨形虫的检测应用中已经十分成熟，并且是世界动物卫生组织（OIE）推荐的诊断方法之一。如今已经有很多可用于ELISA 诊断马属动物梨形虫病的重组蛋白，其中T. equi 的（EMA-1、EMA-2）和B. caballi（RAP-1、Bc48）均可以在大肠杆菌中进行表达，并有很好的试验效果。Wang 等[19]从我国10 个省份收集1 990 份临床健康马的血清，使用间接ELISA 对重组马泰勒虫（T. equi）裂殖子抗原2（rEMA-2）和驽巴贝斯虫（B. caballi）48 kDa 棒状体蛋白（rBc48）进行检测。结果显示，B. caballi 和T. equi 感染阳性率分别为1 018（51.16%）和229（11.51%），混合感染的样本数为152（7.64%）。近年来，随着分析技术不断进步和蛋白质组学等研究的发展，针对马梨形虫病的免疫性抗原蛋白的研究推进着该技术不断改进。该方法在检测的灵敏度、特异性、高效性等方面都有很大提高，是目前较为标准的诊断方法。

2.2.2 间接免疫荧光抗体检测（IFAT） IFAT 已经用于临床健康的带虫宿主的诊断。该方法是OIE推荐方法之一，广泛应用于世界各地。Laus 等[20]对意大利138 只临床健康的驴采集静脉血样，并针对马泰勒虫和驽巴贝斯虫，使用IFAT 方法检测虫体IgG，结果发现T. equi 和B. caballi 的阳性率分别为40.6%和47.8%，并且在19.6%的动物中检测到双重阳性。该方法已经标准化操作流程，具有很好的检测准确性和灵敏性，但其需要标准抗原片及对照的血清样本进行试验，并对操作人员和实验条件需求较高，普遍作为实验室检测方法。

2.2.3 补体结合试验（CFT） CFT 曾作为一些国家用于检测马属动物梨形虫病诊断的主要方法，现在仍被一些地区广泛用于马匹进口的检验。CFT可准确诊断早期（急性）感染，显示了其良好的敏感性和特异性，但该方法无法识别经过药物已产生抗补体反应的个体。用于CFT 的抗原是通过人工感染马制备的，这引发了有关于动物福利问题的讨论。因此，CFT 很可能在未来停止使用，而IFAT 和c-ELISA 取而代之成为马属动物梨形虫病在马匹国际贸易上主要的检测手段。另外，由于抗体检测限和交叉反应性，血清学测定存在局限性，在某些情况下有误诊的情况发生。目前该方法逐渐在世界各地停止使用。

2.3 分子生物学诊断方法

2.3.1 聚合酶链反应（PCR） PCR 作为一种常规分子生物学诊断方法，是诊断马梨形虫病的常见方法。PCR 方法的灵敏度已经显示出高于显微检测方法的灵敏度。使用PCR 方法检测寄生虫DNA具有极高的检测敏感性，可检测到染虫率为10-8的2.5 μL 血液样品中的病原DNA，从而检测处于低水平寄生虫血症的持续感染情况[21]。为了增加PCR 反应的灵敏性，科研工作者们设计出了巢式聚合酶链反应（nested PCR）。巢式PCR 可诊断亚临床感染，防止受感染动物出口，以及确定药理学治疗的效率。Mahmoud 等[22]使用巢式PCR及IFAT 方法分别对来自埃及的88 匹马和51 头驴的血液感染情况进行了检测，结果发现巢式PCR的阳性检出率（56.8%）高于IFAT（48.9%）。Alhassan 等[23]通过使用常规及多重PCR 方法对49 份蒙古国的马样本进行检测，证实了存在蒙古马感染；分别使用Bc48 和EMA-1 引物，在多重PCR 和常规PCR 之间取得了完全一致的结果。PCR 方法可直接对病原体的核酸进行检测，具有较强的敏感性；但是在引物设计及目标核酸的选择上较为局限，由于引物二聚体等因素的存在，以及在大量实验样品的检测上需要较长的准备及反应时间，因此操作较为复杂，不适于急性感染的诊断。

2.3.2 荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）与常规PCR 方法相比，real-time PCR 具有特异性强、灵敏度高、稳定性强等优点，广泛用于各种病原体的定性和定量检测。该方法是由美国Applied Biosystems 公司在1996 年推出的定量试验技术，使用荧光染料或荧光标记的特异性的探针，标记跟踪PCR 产物，实时监测反应过程，并结合相应的软件，分析产物并计算待测样品模板的初始浓度。李佳[24]根据T. equi 18S rRNA 保守区域设计了一对特异性引物和Taq Man 探针，建立了T. equi 荧光定量PCR 检测方法。结果显示，该试验所建立的荧光定量PCR 方法灵敏度可达1×101拷贝/μL，是普通PCR 的1 000 倍。使用荧光定量PCR 方法进行临床样本检测，并与普通PCR 进行检测效力比较试验，结果得出常规PCR 的阳性检出率为34%，而荧光定量PCR 的检出率为40 %。Lobanov 等[25]针对T. equi 的ema-1 基因和B. caballi 的18S rRNA 基因设计了一种双重荧光定量PCR 检测方法，并使用来自加拿大和美国的362 份竞争cELISA 阴性马的样品对其进行验证，未发现出现假阳性反应结果。之后使用双重荧光定量PCR、单靶荧光定量qPCR及cELISA 三种方法，对来自于巴西巴贝斯虫高发地区的430 匹未知感染状态的马匹血液样本进行性能评估测定试验。结果证明，三种方法检测阳性率分别为87.9%，90.5%和87.4%。荧光定量PCR 对两种梨形虫物种具有较高的灵敏度。目前，该方法结合Taq Man 探针可实现在一次反应中检测出两种虫体。因其需要的荧光定量PCR 仪器以及荧光探针的价格较为昂贵，因此不适于田间检测。

2.3.3 环介导等温扩增技术（LAMP） LAMP作为一种快速扩增技术，具有敏感、简便、快速等特点。在疫病检测、食品安全、胚胎性别鉴定等方面得到了广泛的应用，而且非常适合于现场检测[25]。该技术是由日本学者Notomi 等建立，克服了PCR 技术相关设备较为昂贵的缺点，并且可以更加直观地观察试验结果，自建立以来已广泛应用到了各种核酸DNA 的检测试验当中。谢俊仁[26]通过分析T. equi 和B. caballi 的18S rRNA 基因序列的差异，分别设计了T. equi 和B. caballi 的特异LAMP 引物组，通过使用不同马属动物DNA 来验证所建立方法的特异性，并且通过多种方法对临床样本进行检测，结果表明LAMP 方法的敏感性分别相当于或高于常规检测方法，可以有效地鉴别T. equi 和B. caballi。虽然该方法可应用于现场检测，但由于反应试剂稳定性较差，常出现假阳性诊断结果，仍未能广泛应用于田间检测。

3 讨论

本文从病原形态学、免疫学及分子生物学三个方面对目前用于马梨形虫诊断的方法进行了简要概述。针对开展田间检测而言，病原学形态学检测方法仍是在患马发病时使用较多且最为便捷的检测方法。但在隐性感染阶段及对马梨形虫病进行流行病学调查时，研究人员常选择从病原形态学、免疫学及分子生物学三个方面，通过多种检测方法相结合的方式来对马梨形虫病感染情况进行确认。

虽然有大量的检测方法可应用于马梨形虫病的检测，但需要各种大型仪器作为支撑并且对操作人员有着较高的技术要求，而广泛应用于田间检测的方法目前仍以染色镜检法为主，但该方法在阴性感染阶段及染虫率较低的情况下极易造成漏检。因此，需要一种操作简便、诊断准确、成本低廉的可在田间广泛推广的方法。

目前，对于该病检测方法的研究主要侧重在寄生虫免疫学和分子生物学研究。免疫学研究方面更加倾向于对该病候选抗原蛋白质的筛选，特别是对诊断目标蛋白质及免疫候选因子的研究。分子生物学研究方面，数字PCR、RPA 方法等各项新生检测技术有很好的应用前景。其中，RPA 作为一种等温核酸扩增技术，灵敏性高，易于操作。另外，RPA 与荧光探针及测流试纸条相结合的检测方法也广泛的应用于生物样本的检测。该方法在马梨形虫诊断的应用上具备较好的前景，适合在田间推广使用。此外，得益于国际社会一直以来对同样是寄生于红细胞内的血液原虫病-疟疾的大量关注，有很多简便快捷的检测新技术值得马梨形虫病的田间检测方法研究借鉴。