河西走廊玉米种子携带病原菌真菌的研究

郑天翔曹 礼

(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000)

河西走廊作为全国最大的杂交玉米种子生产基地，主要集中于武威、张掖、酒泉三大农业灌溉区，2013年以来，制种面积每年稳定在10万hm2左右，占全国制种面积的39.3%，制种产量5.8亿kg，占全国制种量的42.6%[1]，河西走廊玉米种子质量对全国玉米产业的发展起到至关重要的作用。然而，随杂交玉米种子生产基地土地连作突出、抗病性差的亲本组合大面积单一种植、追求高密度与高水肥的耕作制度改革、气候变暖而生育期提前和病原越冬基数增多[2]等因素为玉米苗期、穗部病害、叶部病害等的发生创造了条件。据调查，河西走廊玉米苗枯病在一般地块发病率在10%左右，发病重的地块40%～60%[3]，穗腐病病株率62.5%～82.2%[4]，叶部病害大斑病病株率39.3%～97.06%、小斑病病株率26.12%～96.57%、弯孢菌叶斑病病株率12.9%～93.22%[5]。致使种子带菌率上升，种子病原菌结构发生变化，引起种子变色腐烂，种子的发芽率低、发芽势弱，种子带菌成为影响河西走廊玉米种子质量的制约因素。

各国对种子带菌检验采用方法不同，国外早期针对真菌采用“孵化检验”或田间种植检验的方法[6]，后逐渐采用抗生素或其它选择性媒介、LIST、PCR 等技术，极大地提高了检验灵敏度和效率[7]；国内多地对玉米种子带菌检验，认为玉米种子带菌是导致种子活力下降的重要因素[8]，高晓梅等[9-10]报道辽宁省玉米种子真菌达16个属26个种，龙书生等[11]鉴定出陕西关中西部玉米穗粒腐病病穗籽粒表面和内部寄藏的真菌有11个属14个种。但作为全国最大玉米制种基地，河西走廊的种子带菌情况还未见系统性研究报道。为此，以河西走廊玉米制种基地生产的种子为研究对象，检测种子带菌种类、优势种群，旨在为预防控制玉米种传病害、检验检疫、药剂包衣和生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

分别在张掖市12个制种企业、武威市4个制种企业、酒泉市4个制种企业采集新收获的50个玉米品种(组合)种子。

1.2 种子带菌检测方法

1.2.1种子外部带菌检测

每个品种随机选取100粒种子，放入灭菌的250 mL三角瓶中，加50 mL无菌水后充分振荡，吸取10 mL悬浮液，2 000 r/min离心10 min，倒去上清液，加5 mL无菌水均匀悬浮后取出适当体积用无菌水进行系列梯度稀释，每个稀释梯度菌悬液吸取100 mL涂抹到直径90 mm的PDA平板上(PDA中加适量乳酸抑制细菌)，每个浓度3皿，置20 ℃恒温箱中黑暗条件下培养观察，5 d后观察平板上的菌落，根据稀释倍数和检测种子数计算种子外部携带真菌的孢子负荷量和检出真菌的分离比例。每个供试品种重复4次[8]。

孢子负荷量(个/粒)=(3皿菌落总数/0.3 mL)×稀释倍数×50 mL/100粒；

分离比例(%)=(某类真菌菌落个数/菌落总数)×100%。

1.2.2种子内部带菌检测

每个供试品种随机选100粒，先将玉米种子在70%酒精中浸15～20 s，然后移入0.1%升汞液中杀菌0.5～1 min，再用无菌水冲洗3次。将经表面杀菌的玉米籽粒置于盛有PDA平板上，每皿摆放10粒，每品种重复3次。于25℃温箱中培养4～5 d，当种子周围长出菌丝体或种子表面有霉层时，将菌丝或霉层移入PDA培养基上进行纯化培养，待长出籽实体后进行真菌鉴定[8]。

种子带菌率(%)=(带菌种子数/检测种子总数)×100%；

某菌分离率(%)=(带某菌种子数/检测种子总数)×100%。

1.2.3病原真菌的鉴定

根据分离到的真菌在PDA培养基上培养特性，镜检病菌形态特征，并参照相关真菌鉴定的工具书[12-14]。

2 结果与分析

2.1 玉米种子外部带菌情况

从培养平板菌落特征及显微镜检验看，共检出镰刀菌属(Fusariumspp.)、根霉属(Rhizopusspp.)、青霉属(Penicilliumspp.)、链格孢属(Alternariaspp.)、凸脐蠕孢属(Exserohilumspp.)、平脐蠕孢属(Bipolarisspp.)、黄曲霉(Aspergillusspp.)、枝孢属(Cladosporiumspp.)、黑孢霉属(Nigrosporaspp.)、木霉菌属(Trichodermaspp.)等真菌10个属。其中，镰刀菌主要检出串珠镰刀菌(F.moniliforme)和禾谷镰刀菌(F.graminearum)2个种；显微镜检验洗涤液时，除检测到上述几种真菌外，还可检测到黑粉菌属(Ustilagospp.)、腐霉菌属(Pythiumspp.)2个属。

从分离比例和孢子负荷分析看，各种品种所携带的病原真菌种类及数量、孢子负荷量均有所差异。其中检出率最高的是镰刀菌(Fusariumspp.)，豫玉22分离率最高(达67.74%)，良玉188分离率最低(为0)，平均分离率41.52%。有27个品种分离率在43.75%～67.74%之间，高出平均值达2.23%～26.22%，占分离品种54%；根据分离率的高低，检出依次为根霉属>青霉属>链格孢属>凸脐蠕孢属>黄曲霉>平脐蠕孢属>枝孢属>木霉菌属>黑孢霉属；从每粒种子表面孢子负荷量分析，品种浚单29、郑单958孢子负荷量最高(600个/粒)，品种良玉188负荷量最低(116.67个/粒)，平均负荷量322.67个/粒。有21个品种孢子负荷量超过平均值，为333.33～600个/粒，高出平均负荷量在10.66～277.33个/粒，占分离品种42%。品种的孢子负荷量Log值高于平均值2.48的占分离50%。

2.2 玉米种子内部带菌情况

经分离培养法检验，检出的真菌种类与洗涤培养法检出的真菌相同，但分离率与带菌率与洗涤培养法不同。分离结果显示，检出的内部带菌种类间差异比较明显，镰刀菌(Fusariumspp.)分离率最高为豫玉22，达61.11%，玉油1号、士海718、土海916、海单9号、登海3737、良玉9、良玉188、华农138、华农866、中科16等10个品种上分离最低，为0，平均分离率29.20%，有28个品种分离率超过平均值，为30.00%～61.11%，高出平均值0.8%～31.91%，占分离品种的56%。根据分离率的高低，病原菌依次检出链格孢属>凸脐蠕孢属>青霉属>黄曲霉>黑孢霉属>枝孢属>木霉菌属>根霉属。

试验结果表明，种子带镰刀菌率在品种间也存在不同差异。带镰刀菌率最高的是豫玉22、浚单29，为36.67%。除不带镰刀菌的10个品种外，最低的是鄂玉16、济玉1号、大丰30等3个品种，为3.33%。平均带镰刀菌率为12.87%，27个品种超过平均值，占供试品种的54%；

种子带菌在品种间也具有一定差别。种子带菌的主要菌群有镰刀菌属、链格孢属、凸脐蠕孢属、青霉属、黄曲霉、黑孢霉属、枝孢属、木霉菌属、根霉属等，还有一些未鉴定的菌群；带菌率最高是浚单29，为63.33%。最低是华农138、华农866，为10%。平均种子带菌率37.60%，带菌率高于平均值的品种占48%。

2.3 2种方法的比较

从2种方法分离结果看，一个共同特点是镰刀菌(Fusariumspp.)分离频率最高，且以串珠镰刀菌(F.moniliforme)和禾谷镰刀菌(F.graminearum) 2个种为主，仅镰刀菌分离率有所差别，洗涤检验法平均分离率最高达41.5%，PDA平板法平均分离率最高达29.20%，二者平均分离率相差12.3%，说明镰刀菌既可在种子表面腐生，又可内藏寄生种子内；其次是链格孢属(Alternariaspp.)、凸脐蠕孢属(Exserohilumspp.)通过PDA平板法分离率较洗涤法高，分别达15.95%、10.17%，高出6.85%、5.48%。说明链格孢属、凸脐蠕孢属是玉米种子内藏寄生菌；三是黑孢霉属(Nigrosporaspp.)、黄曲霉(Aspergillusspp.)、木霉菌属(Trichodermaspp.)在PDA平板法中分离率有所上升，分别为5.91%、8.34%、4.40%，较洗涤法分离率高出4.87%、3.05%、1.02%，这3种菌一直被认为是种子的腐生菌，说明玉米种子的寄生性在上升；其他菌在PDA平板法中的分离率低于洗涤法，说明经洗涤消毒后外部腐生的数量在减少。

3 结论与讨论

1) 试验结果表明，从玉米种子外部和内部检出情况看，携带的真菌类群主要有10个属，与高晓梅等[9-10]报道玉米种子携带真菌有16个属有差异，尚未检测到枝顶孢属(Acremonium)、刺毛霉属(Actinomucor)、毛壳属(Chaetomium)、附球菌属(Epicoccum)、串棒霉属(Gonatobotrys)、粪壳菌属(Sordaria)等6个属；从分离率的高低分析，表面携带优势种群为镰刀菌(Fusarium)、根霉菌(Rhizopus)、青霉菌(Penicillium)、链格孢菌(Alternaria)，种子内部寄藏的真菌主要有镰刀菌(Fusarium)、链格孢菌(Alternaria)、凸脐蠕孢菌(Exserohilum)，这与李健强等[15]、徐秀兰等[8]报道相一致；因此，需要密切检验种子带菌和监测种子病害的发生情况。

2) 试验结果显示，河西走廊部分玉米种子带菌率高，带菌量大，50个检测品种中，56%的品种带菌率比平均值高(36.70%)，54%的品种带菌量比平均值大(332.67个/粒)；玉米品种间带菌率及带菌量存在一定差异，如豫玉22、浚单29、郑单958等无论外部、内部带菌率和带菌量均比较高，如镰刀菌、链格孢菌等的带菌率较高，这与田间苗枯病、顶腐病等苗期病害发病率在15%～25%之间是相互吻合。玉油1号、士海718、土海916、海单9号、登海3737、良玉9、良玉188、华农138、华农866、中科16等外部带菌量均比平均值低，内部带菌率为0，田间苗枯病及顶腐病的发病率均低于5%；分析认为，带菌率和带菌量高低与品种繁种年份长短、连作现象、亲本组合的抗病性关系密切。带菌低的繁种年份较短，一般3～5年。有些亲本材料对优势种群的抗病性较弱，而亲本材料既在河西走廊繁殖，又在河西走廊制种，侵染循环的周期缩短，造成苗期病害严重发生。一般带菌率和带菌量高的品种在河西走廊繁种年份均在10年以上，土壤连作现象突出，影响土壤中有益微生物数量和土壤活性[16]，种子带菌导致土传病害的加重。

3) 玉米种子分离病菌与玉米果穗腐病具有一定的相关性。如镰刀菌、平脐蠕孢、链格孢菌、青霉、木霉、曲霉等分别引起穗腐病，黑孢菌引起裂轴病，根霉引起果穗煤污病，枝孢霉引起黑霉病[17]。其中一些病菌是先寄生于叶、茎引起叶部和茎部病害，从苞叶侵染果穗而附着于种子表面，之后逐渐寄藏于种子内。如镰刀菌、平脐蠕孢引起茎基腐病，镰刀菌、链格孢菌引起鞘腐病，链格孢菌、平脐蠕孢、枝孢霉引起叶斑病[17]，这些病菌由茎、叶、叶鞘等部位向果穗扩展，造成种子带菌；一些是腐生菌青霉、木霉、曲霉、根霉、黑孢霉等在果穗收获时，因受田间钻蛀性害虫危害、鲜穗堆集而通风不良、凉晒时遇多雨或潮湿环境条件等因素影响，腐生菌迅速繁殖附着或侵染种子内部，形成致病菌，造成种子带菌而成为下一季玉米苗期病害主要侵染源；有关携带真菌的寄生部位的研究，马奇祥等[18]报道玉米种子外部主要腐生于果皮与种皮(籽实皮)表面，内藏真菌主要寄生于胚乳内。这方面报道还不多，有待进一步研究。