海洋环境中细菌耐药性研究进展

赵小慧 苏洁 樊景凤,4 马悦欣

(1 大连海洋大学，水产与生命学院，大连 116023；2 国家海洋环境监测中心，大连 116023；3 国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室，大连 116023；4 国家海洋局第四海洋研究所，北海 536000)

目前致病菌耐药性的增加和扩散已经成为全球公共安全问题。近年来，由于抗生素的滥用加速了细菌耐药性在自然环境中的传播扩散。这些耐药微生物可通过直接或者间接接触(如食物链)等途径进入人体，进而危及公共健康。根据欧洲疾病预防与控制中心以及欧洲药监局的统计数据，每年大约有25000欧洲人(5.1/100000居民)死于耐药性细菌感染[1]。美国疾病预防与控制中心2013年统计报道，美国每年至少有两百万人感染各种耐药性细菌，其中耐药性细菌感染直接导致的死亡人数超过23000人[2]。为积极应对细菌耐药带来的挑战，维护人民群众身体健康，2016年国家卫生计生委等14个部门联合制定了《遏制细菌耐药国家行动计划(2016—2020年)》[3]。

海洋占地球总面积的70.8%，是一个具有多层次耦合的自然系统。与大陆环境相比海洋环境有着明显的特点。首先海洋中存在着水-汽-冰三态转化的复杂过程，其次海水在包括波浪、潮汐和海流等水文动力下不停运动着。而这些特点都会直接或间接影响海洋环境中的微生物生境进而影响细菌耐药性的传播扩散。研究表明海洋环境已成为携带抗生素抗性基因(ARGs)的微生物传播扩散的重要媒介之一[4-6]。本文系统阐述了海洋环境中细菌耐药性的产生原因、流行现状及传播途径，并提出了今后的研究重点。

1 海洋环境中细菌耐药性产生原因

抗生素在海洋环境中可能发生水解、光解和生物降解等一系列降解反应[7]。然而不同抗生素在海水环境中残留时间长短不一，部分抗生素进入水体后降解缓慢(如土霉素，即使在低浓度下也能存在很长时间[8])，在水体中能较长时间地维持一定浓度，细菌在药物选择压力下就产生了耐药性[9]。因此海洋环境就成为细菌耐药性传播扩散的理想场所。除了天然存在于原始环境的细菌耐药性和抗生素抗性基因[10]，海洋环境中有3种可能的途径会导致细菌耐药性发生：第一种途径是陆源耐药性细菌随着河流径流入海；第二种途径是人类活动使用的抗生素随地表径流入海，海洋细菌在其长期选择压力下产生抗性；第三种是对海洋土著生物分泌的活性代谢产物产生的抗性。

抗生素污染源可直接或间接进入海洋环境，海洋环境中的抗生素来源主要有3种：一种是工业、城市生活废水中的残留抗生素直接流入海水水体或经地下水间接污染海水水域。城市的污水处理系统并不能完全去除废水中的残留抗生素，某些抗生素在污水处理过程中无法被有效地去除，去除效率一般为60%～90%[11]；第二种是来源于水产养殖业抗生素药物的滥用。抗生素被大量用于水产经济动物疾病的预防和治疗，或以饲料添加剂的形式用来改善饲料转化率促进动物的生长。有研究证明由于大部分的抗生素很难被动物吸收利用，因此大约有30%～75%的抗生素以母体化合物形式随粪便和尿液排出体外[12]，这些抗生素返回到环境中，对公众健康构成潜在威胁[13-14]。因此直接加到水体用于治疗或预防病害的、未被水产养殖生物吸收的和随粪便排泄的抗生素可能聚积于水体及底泥沉积物中造成污染[15]； 另一种是来源于临床医疗机构的废水排放。抗生素作为治疗用药在临床上得到广泛应用且使用量巨大。抗生素使用后，少部分经过机体新陈代谢而被吸收或代谢，但大部分以原形或活性代谢物形式随粪便、尿液排出体外[16]，最终通过生活污水、医院废水、药企废水及废弃物等途径进入环境[17]。例如，Szekeres等[18]发现与磺酰胺类抗生素有关的磺胺I类抗生素抗性基因(sul1)和磺胺II类抗生素抗性基因(sul2)存在于罗马尼亚研究场所的医院废水中。

2 海洋环境中细菌耐药性流行现状

近年来，细菌耐药性研究重点逐渐由土壤、养殖场、临床环境和污水处理系统中转移到河口及海洋环境中。目前大部分海洋环境中细菌耐药性的研究集中在可培养细菌的耐药性分布状况、抗生素抗性基因及其丰度检测方面。蒋魁等[19]对来自于2012—2014年南海海水养殖鱼类中分离到的病原菌哈维弧菌进行细菌耐药性检测发现，在广东、海南和广西地区养殖鱼类中所分离到的哈维弧菌耐药谱具有复杂多样性特征，随着时间年份的递增，哈维弧菌耐药谱种类也发生着变化，耐药谱不断扩大延伸。海滩娱乐水域耐药性问题也是人们关注的焦点，如海口假日海滩浴场、三亚大东海浴场中分离到的革兰阴性菌耐药性检出较为普遍，耐药菌的构成比达到了45.0%[20]。王玥等[21]对大连星海浴场近岸海水中分离得到的41株大肠埃希菌进行药敏试验，结果显示大肠埃希菌的多重耐药率达到34%，表明大连星海浴场海水中大肠埃希菌多重耐药状况严重。马来西亚马塘红树林河口中分离到的耐药性大肠埃希菌对氨基糖苷类和β-内酰胺类抗生素的耐药率达到83%和37%[22]。此外，研究发现马来西亚半岛近岸海洋环境中耐药细菌的流行率很高[23]。如分离自马来西亚北部半岛近岸海水和沉积物样品中的气单胞菌和弧菌均表现出对至少5种抗生素的耐药性[24]。马来西亚近岸海水中分离得到的耐药性弧菌的多重耐药率为68%[25-27]。不仅河口和近岸海洋环境中的细菌耐药性流行率很高，马来西亚海产品中分离得到的弧菌对各种抗生素也均具有耐药性[23]。在可供游客参观游览且被列为自然保护区的无人居住岛屿Berlenga的近岸海水中也已分离到多重耐药性大肠埃希菌且多重耐药率达到39%[28]。

海洋环境中分布着多种抗生素抗性基因，如Hatosy等[29]研究发现44%的海洋优势微生物类群(例如Pelagibacter、原绿球藻和弧菌等)中均发现了抗生素抗性基因的存在。Zhu等[30]在中国沿海4000多公里的18个河口沉积物中分析了ARGs，检测到超过200个不同的抗性基因。在高丰度和多样性丰富的抗生素抗性基因中，磺胺类和四环素类两类抗生素抗性基因检出率较高。邹世春等[31]发现北江河水域中sul1和sul2基因含量水平显著较高，污染较严重。渤海湾海水和沉积物中sul1和sul2检测率为100%且丰度范围为10-5～10-2/16S基因拷贝[32]。Gao等[33]在河口、附近的沿海和海洋流域中检测到所有类型的ARGs中，sul-ARGs和tet-ARGs具有最高的检测频率，并且平均检测率分别达到100%和87.9%。

海洋环境中可培养菌株耐药性研究结果表明，海洋环境尤其是受人类活动影响较大的海域中细菌的耐药率和耐药程度严重，耐药谱种类繁多。其中海水养殖致病菌、海洋环境中分布广泛的革兰阴性菌、环境粪便污染指示菌大肠埃希菌等是主要的研究对象；海水养殖环境、海水浴场、近岸海洋环境是主要的研究水域。抗生素抗性基因在河口、近岸海水及海洋环境中被大量检出，具有种类丰富、分布普遍等特点。在众多的抗生素抗性基因中磺胺类及四环素类抗生素的研究较多。海洋环境中细菌耐药性问题日趋严重，为更有效避免耐药性在海洋环境中的广泛传播扩散，保护公众健康，开展细菌耐药性相关研究是刻不容缓的。

3 海洋环境中细菌耐药性传播扩散途径

海洋环境已逐步成为耐药性细菌和抗生素抗性基因的重要“储存库”[34-35]，细菌耐药性可通过增殖动力学垂直传递给微生物后代，也可通过水平基因转移(horizontal gene transfer,HGT)在细菌中传播，最终导致环境细菌成为各种抗生素抗性基因的天然储存库[36]。

耐药决定因子通常位于染色体和可移动遗传元件(如质粒、游离DNA、转座子、整合子等)上，这些可移动遗传因子可以在不同分类和生态类群的细菌间发生转移[37]。研究发现水平基因转移是耐药性传播的主要原因[38]。

因此，本文着重讨论海洋环境中细菌耐药性的水平基因转移机制。越来越多的研究表明，细菌耐药性可在可移动遗传元件的作用下，通过水平基因转移对环境中的共生菌和病原菌之间传播扩散。水平基因转移包括3种机制：接合、转化和转导。接合相比转化提供了更有效的进入宿主细胞的方式；接合相比噬菌体转导能够提供一个更广泛的宿主范围。因此认为接合对ARGs的传播影响最大，但最近研究表明转化和转导对ARGs播散也起到不可忽视的作用。

3.1 接合

接合(conjugation)又称接合作用，是供体细胞通过性菌毛与受体细胞互相沟通，将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌，通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的遗传重组现象[39]。接合现象既可以发生在同种细菌中，也可以发生在同属不同种间的细菌中，传递的可以是不同种类抗生素的耐药性。这种方式主要出现在革兰阴性细菌中。赵莎等[40]研究大连付家庄海水浴场中大肠埃希菌耐药性时发现抗生素抗性基因可通过质粒接合方式在同种属环境菌株中进行传递。说明海洋环境中抗生素耐药性可通过质粒接合方式进行传播扩散。

3.2 转化

转化(transformation)是受体细菌通过直接吸收来自供体细菌或环境中含有特定基因的游离DNA片段，并在受体菌内整合表达，从而获得相应的遗传现状，使其获得抗性的过程。Vries等[41]研究表明,至少有87种细菌可以通过自然转化吸收胞外游离的DNA并发生水平转移，包括假单胞菌和不动杆菌等菌属。土壤细菌间耐药质粒可通过接合或转化的方式传递ARGs[42]。但游离的DNA在大洋海域中的浓度很低(0.6～88μg/L)[43-44]，而在游离DNA浓度过低的情况下发生高频率转化的概率较小。海洋环境中细菌耐药性通过转化方式水平基因转移的机制还有待进一步研究发现。

3.3 转导

转导(transduction)是指噬菌体通过侵染宿主细胞，组装子代噬菌体时错误地将菌体内的外源基因片段(抗生素抗性基因)带入宿主细胞，整合到宿主细胞遗传物质上并得以表达，从而使宿主细胞表现出抗性的基因转移机制[45]。噬菌体对于细菌微生物在任何环境中的塑造起着重要的作用。噬菌体可通过局限性或普遍性转导有利于微生物宿主的基因，进而促进自身的生存和传播。转导作用主要发生在同种细菌中，且传递的是同一种抗生素的耐药性，这是因为噬菌体有特异性，并且所传递的DNA量很小。可转移的DNA序列包括染色体DNA和MGEs，如质粒、转座子及基因组岛[46]。研究发现，海洋环境介质中，海洋噬菌体的种类多、浓度高，以噬菌体为媒介，以转导为手段的遗传物质传递的频率也会较高[47]。海洋中还有数量众多的浮游病毒，而且在大量海洋细菌的基因组中也发现有前噬菌体(prophage)基因的存在[46]。噬菌体在水生细菌耐药性的传播扩散方面起到重要作用。Jiang等[46]证明了海洋噬菌体宿主分离物能够在细菌宿主中转移抗生素抗性质粒，因此转导可能是海洋环境中普遍发生的水平基因转移方式。

3.4 基因转移因子

一般认为只有以上3种机制介导了水平基因转移，但是近年来，研究者们在光和紫色非硫细菌(Rhodobacter capsulatus)中发现了一类新的水平基因转移机制。这是一种不是由典型噬菌体所介导的，但是与病毒介导的普遍性转导相似的转移机制[48]。研究者将这种介导水平基因转移的物质称为基因转移因子(gene transfer agent,GTA)，并认为GTA有可能是海洋生态环境中介导水平基因转移的主要机制。研究发现，64个含有原病毒的海洋细菌基因组中至少1/3的前噬菌体基因是编码GTA的基因[49]。Bires等[50]也验证了海洋中优势菌群(α-proteobacteria和poseobacter)的代表菌株DSS-3可以借助GTA发生水平基因转移，而且通过GTA的水平基因转移并不需要细胞之间的接触。

4 海洋环境中细菌耐药性传播扩散的影响因素

近年来，许多研究人员更加注重耐药性的传播扩散过程和耐药机制。结果表明，基因突变并不能全面解释耐药性的快速大量传播。在自然环境中，垂直传播和水平基因转移在耐药性的传播过程中起着至关重要的作用。耐药性传播过程是受到复杂的环境因素和多种理化因素综合影响驱动的。因此，全面了解海洋环境中耐药性传播的影响因素将有助于阐明细菌耐药性变化的趋势，有助于改善人类健康和生态安全。

4.1 外部影响因素

4.1.1 外源抗生素

外源抗生素是影响海洋环境中耐药性传播扩散的重要影响因素之一。而外源抗生素与人为活动是密不可分的。邹世春等[31]对北江各采样点所获得的磺胺类抗性基因污染水平与3种磺胺类抗生素总浓度的定量分析结果进行比较后发现，二者具有一定的相关性，这表明外源性抗生素对河流的污染是诱导抗性基因的重要因素。马来西亚马塘河口耐药性大肠埃希菌的相关研究结果表明人为活动导致的抗生素排放加剧可能是大肠埃希菌多重耐药性产生的主要因素[22]。用于娱乐活动，灌溉和其他目的的河流也已成为耐药性传播的重要媒介[51-53]。Niu等[32]研究发现渤海湾水体及沉积物中抗生素与相应的抗生素抗性基因具有相关性，表明抗生素在抗生素抗性基因的产生和转移中起重要作用。

4.1.2 降雨

现有研究表明降雨也会影响海洋环境中抗生素抗性基因的丰度。暴风雨可以通过搅动、混合等方式将沉积物中的耐药细菌和抗生素抗性基因释放到海水中。最近一项研究报道，美国弗吉尼亚州Stroubles Creek流域丰水期样品中sul1、sul2、tetW和ermF抗生素抗性基因明显高于枯水期样品中的浓度[54]。Ahmed等[55]在美国佛罗里达州Tampa湾的丰水期和枯水期间，通过对几个雨水排放口中的抗生素抗性基因浓度进行测定，结果表明在丰水期样品中，整合子基因Intl2和Intl3的检测率增加了42%。且在检测到的抗生素抗性基因中，与枯水期相比，在丰水期期间收集的样品中部分抗生素抗性基因的相对丰度(以ARGs GC/16S rRNA GC计算)显著升高，表明降雨可能通过影响外源抗生素浓度和整合子浓度从而间接影响耐药性的传播扩散。

4.1.3 环境理化因子

抗生素随河流径流入海后，浓度会被稀释减少。当抗生素浓度较低时，细菌耐药性与外源抗生素之间的关系变弱。其他因素可能替代抗生素的作用影响了细菌耐药性的传播和抗生素抗性基因的转移[33]。

重金属可能是抵消降低河口和海洋环境中垂直传播效果的主要因素之一。当抗生素选择压力较弱时，它们也可能在抗生素抗性基因的传播扩散中发挥重要作用。Lu等[56]对两个河口的sul-ARGs浓度变化结果的统计分析表明，几种重金属与sul-ARGs呈现显著正相关，且Pearson的相关系数要高于抗生素残留和sul-ARGs之间的相关系数。这表明，在河口和海洋环境中重金属可能直接和间接地促成抗生素抗性基因的扩散，影响抗生素抗性基因的分布和传播。

除了重金属，其他环境因子也会影响耐药性的传播扩散。Yang等[57]研究表明酸性(pH=4)水环境不仅影响抗生素抗性细菌(ARB)的群落组成，还可能影响整合子介导的水平基因转移，进而影响流域中抗生素抗性基因的相对丰度。郭业彬等[58]研究长江水系中产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBL)大肠埃希菌(Escherichia coli)耐药基因转移的影响规律时发现温度和pH值对产ESBL大肠埃希菌耐药基因水平转移影响明显。Lu等[56]研究发现，随着盐度的增加，sul-ARGs丰度的显著降低。

4.2 内部影响因素

此外，还有研究发现环境中I类整合子也是影响抗生素抗性基因传播扩散的重要因素。例如，Lu等[56]研究发现sul-ARGs的相对丰度与int1的相对丰度呈显著正相关。Niu等[32]对I类整合子与抗生素抗性基因的回归分析结果也表明，I类整合子促进了sul1和sul2的传播和扩散。另有研究显示环境中的微生物群落结构与细菌耐药性也有着密切的关系[30,59]。Frost等[60]通过对体外竞争实验研究抗生素抗性和敏感菌株之间的相互作用发现细菌群落的密度和空间结构对于β-内酰胺抗生素耐药性的上升可能是至关重要的，同时结果证明结构化群落对抗生素抗性的选择具有复杂且令人惊讶的影响。

5 研究展望

随着陆源抗生素的迁移及人为因素影响，海洋环境逐渐成为耐药性细菌和抗生素抗性基因的储存库。然而，目前对海洋环境中细菌耐药性的研究仍然很有限，许多新的耐药基因或抗性机制尚未被发现认识。随着抗生素种类的不断推陈出新，可能会产生以前未被发现的针对某种抗生素的耐药基因，已知的耐药基因也会出现突变从而产生新的耐药基因。这些新的耐药基因还需要进一步研究发现。此外，一些已知的耐药机制还尚未在海洋环境中得到证实。同样现在一些已经被发现但功能未知的耐药基因的耐药机制也需要进一步研究探索。虽然已知影响细菌耐药性传播扩散的因素有很多，但在注重生态环境的今天如何有效控制海洋环境中耐药性的传播还是个未解难题。很多研究表明海洋环境中细菌耐药性与其中微生物的群落结构有着显著相关性，但还需对其关联性进行更深入的分析解释。各种复杂的迁移运输导致了海洋环境中抗生素的迁移污染，也留给我们许多问题去发现和解决。