协同致死效应在肿瘤研究中的现状*

刘东明 综述 郭华 审校

传统意义上将“单一基因的缺陷不会对细胞产生杀伤作用，当两种或多种基因同时缺陷时才可以杀伤细胞”这一现象称为协同致死效应［1］。近年来，基因组测序的进展促进了恶性肿瘤治疗观念的转变，即可通过短时间内鉴别出患者肿瘤细胞和正常细胞间的遗传和表观遗传的变化，为肿瘤的精准治疗提供依据［2］。特异性致癌基因的改变不仅揭示了促进肿瘤进展的生物学变化，还可以针对这种改变进行靶向治疗［3］。因此，基于肿瘤基因组个体化治疗的应用越来越广泛［4］。目前，大多数基因的靶向治疗均是基于“致癌基因成瘾”（oncogene addiction）这一现象进行干预，即特异性干预肿瘤所依赖的致癌基因或致癌通路。尽管一些小分子抑制剂已被证明对一些肿瘤的致癌基因有效，但并非所有的恶性肿瘤均具有该类致癌基因，相反获得性耐药却更为常见［5］。对于不能通过传统小分子抑制剂直接治疗的恶性肿瘤，可利用另一靶点作为致癌和非致癌基因间相互作用的桥梁，进而产生相应的协同致死效应。

1 协同致死效应概念的提出与演变

协同致死效应源自果蝇和酿酒酵母这类模式生物的遗传研究。Dobzhansky 等于1946年首次提出协同致死效应的概念，其在黑腹果蝇研究中观察到若有两个基因同时发生突变，就可能会带来致死性的结果。1991年，Bender 等在出芽酿酒酵母实验中发现大部分基因彼此之间存在这种协同致死效应，这些基因之间的协同致死关系也可应用到人类肿瘤的研究中。Hartwell 等［6］于1997年验证了这一观点，表明模式生物的遗传学研究可以推广应用于识别人类恶性肿瘤中的药物靶点，并首次提出了协同致死效应的发展可能为抗癌疗法提供新策略的观点。

协同致死效应是揭示正常细胞和肿瘤细胞生物学机制的有效途径，但其最终的目标是为个体化治疗提供依据。2005年通过上述假说所设计的实验发现了乳腺癌和其他癌症中的高频突变基因BRCA1和BRCA2 与PARP1 之间的协同致死效应［7-8］。具体来说，作为真核细胞中催化聚核糖化这一过程的DNA修复酶，PARP在修复细胞内异常DNA损伤和维持基因组完整性等方面有着重要的作用。但细胞内修复异常DNA损伤的系统并不是唯一的。正常情况下抑制肿瘤细胞中PARP的活性，可以导致其单链DNA断裂的积聚，但肿瘤细胞内的另外一套修复系统，如乳腺癌、卵巢癌等易感基因BRCA1/2 所介导的同源重组途径，可以修复DNA损伤、维持染色体的稳定。因此，抑癌基因BRCA1/2 缺陷或突变的卵巢癌细胞对PARP 抑制剂的敏感性是正常细胞的1 000 倍，在此基础上抑制PARP 的活性可以产生更好的靶向杀伤肿瘤细胞的效果。PARP 抑制剂于2009年首次在BRCA1/2 突变的生殖细胞系肿瘤中通过协同致死效应被应用于临床试验中，同时也是目前唯一被批准用于癌症患者的协同致死药物［9］。这一发现引起开发PARP 同类抑制剂的热潮。尤其是使用大规模的RNAi 筛选技术发现了一大批潜在的协同致死基因靶点［10］。

2 协同致死效应的相互作用形式

在协同致死效应中，对于细胞产生的杀伤作用不仅依靠其相应靶点的突变，还可以在靶向作用肿瘤细胞中“功能性缺失”（loss-of-function）的那些突变基因的基础上扩大协同致死效应概念的应用范围［3］。因此，根据能够产生协同致死效应的不同基因组合各自所发生的改变，协同致死效应将分为以下几种形式。

2.1 传统的协同致死效应

如前文所述，两个基因同时发生突变进而杀伤细胞这一过程，是传统的协同致死效应，也可称为“狭义的”协同致死效应。Sinha等［11］通过探讨在人类原发肿瘤数据中特定基因突变时所产生的特异性协同致死组合，预测出3 120个基因突变所产生的145 891个协同致死组合。并发现IDH1 的突变与ACACA 在白血病治疗过程中可以产生协同致死效应。Williams等［12］利用大规模RNAi筛选技术，筛选出结直肠癌治疗中的27 个必需基因，并以此确定了相应的协同致死组合。一般来说，传统的协同致死效应依赖于大规模的基因筛选技术以确定相应的基因突变组合，但其在临床中的应用较为局限［13］。

2.2 扩大范围的协同致死效应

较宽泛的协同致死效应是在传统的协同致死效应的基础上提出的，是指一种突变或过表达的基因与一种常用的小分子抑制剂之间的相互作用［3］。Williamson等［14］研究提示ADID1A的突变可以增强肿瘤细胞对ATR抑制剂的敏感性，ARID1A的缺乏可导致拓扑异构酶2A 的缺失和细胞周期的异常，同时增加其对ATR检查点活性的依赖。因此，在ARID1A突变的肿瘤细胞中，ATR 抑制剂可引发早期有丝分裂、基因组不稳定性和细胞凋亡，进而产生协同致死效应。Azzariti 等［15］研究表明SHP2 基因的低表达可增强HCC 细胞对于索拉非尼的敏感性，并抑制其体外培养的HCC 细胞的增殖能力，同时降低其黏附和迁移能力。因此，该研究提出SHP2抑制剂可以增强索拉非尼对于HCC 靶向治疗的疗效，延长这部分HCC患者的生存期。

在肿瘤细胞中，某些基因的过表达可能导致其体细胞拷贝数的变化［16］。肿瘤中过表达基因可通过与协同致死组合基因的抑制剂共同作用，以达到协同致死剂量。这种现象于1991年在酵母中首次被发现［17］，随后Kroll 等［18］依据这种概念筛选出CTF13 与过表达的ORC6基因，发现这两者之间存在着相互作用以杀伤细胞。MAD2 是一种在淋巴瘤、肝癌、肺癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中高表达的基因，Bian等［19］研究证实，通过敲除或者抑制PP2A 的活性，可以与过表达的MAD2 基因产生协同致死效应。具体来说，纺锤体检查点对于确保染色体分离至关重要，从而保持基因组稳定性。MAD2 是纺锤体检查点的关键组成部分，在许多肿瘤细胞中过表达。由于纺锤体检测点通路在酵母和人类之间高度保守，该研究首先在酵母中进行了遗传阵列分析，揭示并分析了MAD2的过表达所诱导13个缺失的基因及其致死率。在候选基因的人类同源物中，敲低PP2A可以显著抑制MAD2过表达肿瘤细胞的生长，这一现象主要是由于PP2A 的抑制诱导了MAD2 的磷酸化并抑制MAD2的蛋白水平，产生了相应的协同致死作用。此外，CKS1B这种经常在乳腺癌、肺癌和肝癌中过度表达的基因与PLK1也可以产生协同致死作用［20］。

以上研究结果均表明针对肿瘤驱动基因涉及的关键信号通路，寻找到基于协同致死效应靶向药物治疗中的协同致死基因，并进行靶向干预，能够提高肿瘤细胞对于靶向药物的敏感性，在一定程度上逆转药物的耐药现象，进而延长肿瘤患者的生存期。因此，肿瘤的协同致死效应在逆转药物的耐药、提高肿瘤治疗疗效上扮演了重要角色，可用于设计靶向治疗的药物组合，设计个体化肿瘤治疗策略，弥补单一治疗的局限性。

2.3 条件性协同致死效应

肿瘤细胞的异质性以及其所在微环境的差异，均可以导致基因的改变，并且大多数为条件性的基因改变［21］。此外，遗传背景对于协同致死效应的影响是双向的，如一些基因间的相互作用需要三个或多个基因的缺失以促进协同致死效应进而产生其相应的表型［22］；而遗传背景的突变有时也会导致协同致死效应的逆转，如53BP1 的缺失可能抑制PARP1与BRCA1/2 在乳腺癌中的协同致死效应。因此，如抑癌基因p53 的缺失以及一些致癌基因的激活均有可能促进或抑制协同致死效应，这也为增加协同致死效应的有效性提供了新方向。

3 基于协同致死效应的相关筛选技术

通过某些无偏倚的筛选系统寻找协同致死作用靶点，是将协同致死效应推广到临床治疗中的重要环节，而相关筛选技术的应用也越来越多地被重视。因此，根据不同的方法，将协同致死效应的相关筛选技术归纳为以下几种。

3.1 全基因组RNAi文库筛选技术

全基因组RNAi 文库是人工构建的，通过诱导RNAi 以抑制不同基因表达的混合文库，其可以用于建立“功能性缺失”的细胞库，进行相关表型的筛选［23］。在肿瘤细胞中，RNAi 文库可以利用细胞活性测定以筛选出具有抑制肿瘤细胞增殖的基因，进而发现抗癌通路中的重要靶点［24］。RNAi文库筛选技术作为一种大规模“功能性缺失”的筛查方法，在人类肿瘤细胞中开启了基于协同致死效应的高通量筛选时代［25］。Bou Samra［26］使用基于协同致死效应和转录组学分析的RNAi筛选技术，鉴定可以使BLM和胞苷脱氨酶同时产生缺陷的细胞系，进而寻找能够耐受组成型DNA 损伤和复制应激的基因；进一步发现胞苷脱氨酶和微管相关蛋白Tau 间可以产生协同致死作用。这一研究对同时出现胞苷脱氨酶缺陷和Tau表达上调的恶性肿瘤的抗癌治疗开辟了新的可能性。

3.2 全基因组CRISPR-Cas9筛选技术

目前广泛使用的CRISPR-Cas9 系统是由Ⅱ型CRISPR 改造而来，在分子生物学的研究中有着重要作用［27］。CRISPR-Cas 系统是细菌中的一种免疫形式，适用于从酵母到人类细胞的基因组编辑［28］。作为一种基因组编辑技术，CRISPR 已迅速成为发现哺乳动物细胞中潜在协同致死组合的重要工具。CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物由向导RNA（sgRNA）组成，能够将Cas9 内切核酸酶靶向至基因组中的特定序列。与RNAi 筛选技术不同，CRISPR-Cas9 可以针对核基因组中的任何DNA 序列设计sgRNA，仅通过细胞修复途径来修复双链断裂，不会影响内源性的RNAi通路［29］。鉴于寻找恶性肿瘤靶向治疗中的新靶点一直是癌症研究的方向之一，因此这种基因组编辑与基因组测序相结合的突变靶点筛选技术在癌症中的研究有重要的意义。Shi 等［30］通过CRISPR 系统完成了恶性肿瘤相关药物靶点的筛选，提高了高通量分析基因与疾病间关系的精确度。

3.3 基于基因数据库的筛选技术

除了上述两种筛选技术外，使用人口统计学数据预测基因间的相互作用也可以作为协同致死效应的筛选策略［31］。具体来说，可以通过TCGA数据库或者COSMIC数据库寻找所研究癌种的高频突变基因，以临床数据为基础进行协同致死基因组合的筛选。Jerby-Arnon等［32］使用大样本量临床数据与实验研究数据相结合这一模式开发了集成三个数据源的“DAISY”系统，这其中包括体细胞拷贝数改变的数据、临床样本及细胞系的突变数据、不同细胞系RNAi技术筛选出的基因数据和不同细胞系基因的表达数据。该研究通过“DAISY”系统预测的潜在产生协同致死作用的基因已经得到了相应验证，而“DAISY”系统生成的协同致死基因的组合网络也显示出预测乳腺癌临床预后的前景。

4 基于协同致死效应的临床治疗策略、意义和挑战

近年来，在肿瘤治疗领域中基于协同致死原理的联合治疗受到了广泛关注。大量基础与临床的研究结果表明，针对肿瘤驱动基因所涉及的关键信号通路，利用上文提出的相关筛选技术寻找到相应靶向药物的增敏基因，并进行靶向干预，能够取得较单一疗法更优的抗肿瘤效果［33］。协同致死效应可以扩大抗癌治疗靶点的范围，识别并靶向第二位点基因以促进肿瘤从无药物靶向至可用药物靶向这一过程的转化，完成间接靶向治疗［3］。如在肺腺癌的靶向治疗中，由于DNA 损伤应答激酶ATM 的突变较为常见，Smida等［34］发现ATM的突变与抑制中枢生长因子激酶MEK1/2 活性的药物（如曲美替尼）可以产生协同致死效应。在体内和体外实验中，ATM 的突变增加了肺癌细胞对MEK 抑制剂的敏感性。因此，肺腺癌中ATM 的突变与MEK 抑制剂之间所产生的协同致死效应，对于改善患者分期以及扩大靶向药物在RAS 和BRAF 基因突变肿瘤中的适用性有着重要的作用。在卵巢癌的治疗中，Kedves 等［35］提出，在泛素化水平较低的条件下，Polyubiquitin UBB 可以增强卵巢癌细胞对Polyubiquitin UBC 抑制剂的敏感性，提高这部分患者的生存期。基于协同致死效应的治疗策略有较多优势：1）协同致死效应对于肿瘤细胞特异性突变具有选择性［36］；2）由于目前的放化疗不良反应较大，应用协同致死效应可以降低药物剂量并提高其有效率［37］；3）这种治疗策略适用于恶性肿瘤的各种突变，包括抑癌基因以及无法靶向的基因。

尽管关于协同致死治疗策略的研究较为深入，但也仅有PARP1与BRCA1/2这一对基于协同致死效应的基因组合被应用到临床治疗中。目前面临的主要问题：1）协同致死效应的概念尚不够清晰明确，大多数学者聚焦于研究两个突变基因间的协同致死效应，但也有突变或过表达基因与小分子抑制剂间的协同致死效应组合；2）由于协同致死效应可以应用于基因组、转录组或者蛋白组，因此筛选协同致死效应靶点的前提是进行系统组学的分析，这也无疑增加了分析的难度；3）实现基于协同致死效应的临床治疗策略的最主要障碍为缺少对肿瘤细胞表型深层机制的认识［35］，如遗传学、表观遗传学和肿瘤微环境等因素都会影响协同致死基因组合间的相互作用。因此，除了基因间的相互作用，了解其他因素对于协同致死效应的影响更有意义，能够提供较为丰富的信息，为临床治疗提供更有针对性的指导。明确协同致死效应靶点之间内在的相互作用机制有助于更好地理解协同效应，从功能至靶点的逆向分析也在提供更多协同靶点的同时，也显示分析其内在联系的迫切性和必要性。

综上所述，协同致死效应对于恶性肿瘤的研究有着重要的作用。使用来自模式生物的协同致死组合数据、来自肿瘤全基因组测序的生物信息学预测结果以及人类恶性肿瘤细胞系的直接筛选均可以识别出潜在的药物靶点。但由于个体细胞代谢水平以及肿瘤微环境等差异，需要在阐明其深层机制的基础上进行肿瘤细胞的选择性杀伤，以实现个体化抗癌治疗的可能。