非编码RNA调控Kupffer细胞极化干预肝癌癌前病变恶变的研究进展

侯婵，魏海梁，李京涛，闫曙光，周军

0 引言

世界卫生组织于1978年首次给予“癌前病变”明确的定义：是一种更容易发生恶性肿瘤的组织学改变。癌前病变是某些具有潜在癌变可能性的良性病变，如长期不能治愈，这类病变可能会恶变为癌[1]。肝癌癌前病变主要是指从肝硬化演变为肝癌的中间阶段，肝细胞不典型增生是肝癌癌前病变和肝癌发病的相似病理因素。在2015年制定的《原发性肝癌规范化病理诊疗指南》中将肝癌癌前病变的病理类型分为以下几种：肝细胞异型增生、异型增生灶和低度异型增生结节（LGDN）、高度异型增生结节（HGDN）、肝细胞腺瘤（HCA）[2]。但是，肝癌癌前病变恶变的机制尚不十分清楚，目前普遍认为：（1）肝癌癌前病变细胞的发生是形成肝癌的起始因素；（2）炎性纤维化微环境是导致肝癌形成的驱动因素；（3）肝癌癌前病变细胞与炎性纤维化微环境之间的相互作用最终促进了肝癌的形成[3]。

肝脏中的巨噬细胞是维系肝脏内环境稳态和应对病理变化的重要组分。近年来诸多研究证实，巨噬细胞具有高可塑性和多功能性，在体内和体外不同微环境影响下，可向不同的表型分化，表现出功能差异，此种现象称为极化[4]。巨噬细胞的极化与炎性反应、肿瘤和代谢疾病的发病机制密切相关。库普弗细胞（Kupffer cells, KCs）是位于肝窦中的特殊巨噬细胞，其处于血流入肝的位置，占单核巨噬细胞细胞系总数的80%～90%。KCs的表面具有特殊的功能表型，可防御经肠道来源的病毒、细菌及其代谢产物的侵袭，KCs分泌细胞因子，避免过度的炎性免疫反应，并维持肝脏环境的体内平衡。作为肝癌微环境的特殊组成部分，KCs在肝癌癌前病变的恶变中亦起着关键作用。

1 KCs极化与免疫作用

1.1 KCs极化

KCs表面的膜受体包括Toll样受体（TLR）、NOD样受体、清道夫受体、补体识别和Fc片段受体。KCs通过模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）识别机体内、外源性的危险信号[5]。根据对辅助性T细胞的激活途径进行分类，当KCs被细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、干扰素γ（interferon-γ, IFN-γ）或者白介素4（interleukin4, IL-4）/IL-13等刺激时，会出现两种不同的激活类型，即M1型和M2型[6]。M1型KCs是指巨噬细胞不具有Th1细胞的抗原特异性活化并被其分泌的IFN-γ进一步活化的KCs，此过程也称为KCs的经典激活途径。M1型KCs可调控Th1型免疫应答、杀死细胞内病原体和抑制肿瘤生长等作用。M2型KCs被Th2分泌的IL-4和IL-13选择性地激活，并能增加MHCⅡ抗原的表达，清除细胞表面的甘露糖配体，下调促炎细胞因子的表达，这是KCs的另一种替代激活途径。M2型KCs的主要作用是参与Th2细胞免疫应答，发挥免疫调节作用，促进组织重塑和肿瘤发展[7]。

1.2 KCs的极化与肝癌癌前病变恶变的关系

肝脏在损伤或炎性反应时可激活KCs，激活的KCs可释放大量的超氧化物和活性氧，这些物质对肝脏细胞及其基因的毒性作用可能导致肝脏细胞大量死亡和存活肝细胞的大量增殖，因此，它是促进肝癌癌前病变形成和演进的重要因素。KCs通过自分泌和旁分泌模式释放巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF），抑制其自身的组织穿透力，与癌旁组织相比，癌组织中KCs细胞数量减少。此外，MIF刺激血管内皮生长因子的表达促进肿瘤新生血管生成，这有利于癌细胞的增殖。 因此，在肝癌的发生发展过程中，KCs的作用具有二重性，既具有显著的抗肿瘤作用，也对原发性及转移性肝癌的发展有一定的促进作用。

肝组织中的KCs被来自肠道的LPS等物质激活而极化[8]，活化的M1型KCs分泌促炎细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-23等，可促进局部炎性细胞的聚集，导致局部炎性反应，并促进肝细胞的非典型增生性修复；M1型KCs也可通过吞噬作用将肝脏内不典型增生的肝细胞吞噬，不典型增生的肝细胞与KCs内的溶解细胞酶结合后被杀死。研究发现M1型KCs产生大量炎症因子，通过释放活性氧和氮中间体可以杀死肝脏非典型增生细胞并激活适应性免疫。M1型KCs分泌的TNF-α和IL-1β可募集细胞毒性淋巴细胞（CTL）以攻击肝脏非典型增生细胞；TNF-α对血管内皮细胞具有直接杀伤作用，可激活局部单核巨噬细胞系统，增强NK细胞的细胞毒性作用[9]，且活化的NK细胞能分泌大量的细胞因子，抑制肝癌癌前病变的恶变，发挥其抗肿瘤作用；活化的NK细胞还具有调节KCs的功能，增强其对肝脏非典型增生细胞的杀伤作用，也可抑制肝癌癌前病变的恶性转化。由M2分泌的TGF-β1可有效激活肝星状细胞（HSC）并维持其活性，活化的HSC增殖成肌成纤维细胞样细胞，同时合成释放大量的细胞外基质（ECM）和基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）。TIMP可以降低间质胶原酶活性，减少ECM降解，导致ECM大量积聚，促使形成肝癌癌前病变细胞、炎性纤维化微环境及相互作用，甚至进展为肝癌[10]。同时，活化的M2型KCs分泌促血管生成因子，如VEGF、血小板源性生长因子（PDGF）、TGF-β、成纤维细胞生长因子（FGF）和血管生成趋化因子，并促进肝癌癌前病变周围异常血管增生。 M2型KCs可诱导Th2型免疫应答，促进组织修复和血管新生、对炎性刺激不敏感，并具有低吞噬杀菌作用和抗原提呈能力，可导致肝脏非典型增生细胞免疫逃逸，促进肝癌癌前病变向肝癌发展。因此，在肝癌癌前病变恶变防治中，可适当调控KCs向M1型极化，抑制M2型KCs的极化，从而调控肝癌癌前病变的进展。

2 非编码RNA与肝癌癌前病变恶变的关系

2.1 非编码RNA

微小RNA（microRNA, miRNA）有两种类型：非蛋白质编码的miRNA和蛋白质编码的内含子miRNA。miRNA在生命体中的作用非同小可，可调节人类约30%～90%的基因。其中，占绝大数的是非蛋白编码的miRNA，它是一类碱基长度为19～24 bp的内源性非编码RNA分子，一般位于编码基因的外围。非蛋白质编码的miRNA的功能主要与靶mRNA序列的3'非翻译区（3'UTR）相关，通过与3'UTR的碱基互补配对导致靶mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后水平调节基因的表达。一个miRNA可调节多个靶基因，几种 miRNA也可共同调控单个基因的表达，在miRNA和靶基因之间形成复杂的调节网络[11]。目前的研究发现，miRNA参与多种生理过程的调控，如发育调节、细胞分化和细胞凋亡等，许多miRNA在B、T淋巴细胞、DC、巨噬细胞和其他类型免疫细胞的发育、分化、存活和功能成熟中起着重要作用[12]。

长链非编码 RNA（long non-coding RNAs,LncRNAs）是由基因组中非编码序列转录生成的、长度大于200 nt、不具有翻译成蛋白质能力的RNA，它的异常表达或突变与恶性肿瘤的产生休戚相关[13]。LncRNAs在结构上缺乏显著的开放阅读框架，具有类似于mRNA的结构特征，包括5'末端帽、3'末端的多腺苷酸化尾部、外显子、内含子和剪接位点。LncRNA通过多种生物过程，例如染色质重塑、组蛋白修饰和RNA代谢等来调节基因在表观遗传水平、转录和转录后水平的表达。最近的研究表明，LncRNAs可通过干预肿瘤相关免疫细胞的发育、分化来调控免疫细胞功能、调节免疫相关细胞因子和相关通路的表达，进而影响机体的抗肿瘤免疫反应及肿瘤相关的免疫微环境[14]。

2.2 miRNA对巨噬细胞极化的调控作用

miRNA主要参与巨噬细胞极化的转录后调节，KCs作为肝脏中一种特殊类型的巨噬细胞，在肝癌形成中的作用具有巨噬细胞的共同属性。研究表明，不同外部因素如LPS或IL-4等刺激巨噬细胞可以影响巨噬细胞中某些miRNA的表达水平。

2.2.1 促进M1型KCs极化的miRNA: （1） miR-29b和miR-125a-5p：巨噬细胞极化和肝脏炎性反应主要依赖于核转录因子Kappa B（nuclear transcription factor kappa B, NF-κB）信号通路的激活，肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNF-α诱导蛋白3, TNFAIP3）是NF-κB信号通路的抑制剂[15]。国外学者研究发现，miR-29b和miR-125a-5p可改变KCs极化通路相关蛋白的表达水平，其过表达可特异性抑制人单核细胞系中的TNFAIP3，使M1型KCs的表达增加，参与调控KCs极化。（2） miR-223：研究证实，LPS可诱导巨噬细胞中miR-223的表达，miR-223的高表达可促进巨噬细胞中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，同时也可通过靶向抑制Pknox1促进M1巨噬细胞的极化。（3） let-7c：let-7c也是一种miRNA。Banerjee等[16]证实，let-7c可作为C/EBPδ的抑制剂，其靶向抑制C/EBPδ表达并调控巨噬细胞KCs极化：在KCs中，let-7c的过表达促进KCs向M1的极化，抑制其表达后则极化为M2型KCs，且let-7c表达在M1型KCs和M2型KCs的动态转变中发生变化。

2.2.2 抑制M2型KCs极化的miRNA: （1） miR-19a-3p：研究证实，miR-19a-3p在肿瘤相关巨噬细胞（TAM）中表达明显下降。TAM是浸润在肿瘤周围的巨噬细胞，其促进肿瘤生长、侵袭和转移，并表现出M2巨噬细胞表型[17]。Fos相关抗原1（Far-1）是一种原癌基因，也是诱导M2巨噬细胞极化的重要因子。研究证实，miR-19a-3p通过靶向抑制Fra-1并抑制其下游基因VEGF、STAT3和p-STAT3来抑制M2巨噬细胞的极化[18]。（2）miR-155：Martinez-Nunez等[19]学者研究发现，miR-155可靶向调控M2型KCs极化途径相关因子信号通路中Smad2的IL-13受体α1和TGF-β表达，通过抑制IL-13受体α1和TGF-β来抑制KCs向M2型极化。同时miR-155是TLR信号通路上MyD88蛋白的抑制剂，miR-155通过抑制MyD88蛋白的表达，从而抑制KCs向M2型极化，促进M1型KCs的极化。若抑制miR-155的表达，可促进其靶基因C/EBPβ的表达并促进M2型KCs的极化。（3）miR-146a：Boldin等[20]发现miR-146a的过表达抑制LPS诱导的一氧化氮合酶（iNOS）的增加，促进M2型巨噬细胞的极化；抑制其表达将恢复iNOS的表达，使M1型巨噬细胞极化增加。（4）miR-142-3p：Xu等[21]发现，miR-142-3p是TGF-β信号通路调节因子之一，M2型巨噬细胞中miR-142-3p的过表达选择性地诱导TGF-β受体1的表达，引起M2型细胞凋亡并抑制M2型肿瘤相关巨噬细胞。

2.3 LncRNA对巨噬细胞极化的调控作用

文献报道，LncRNAs的异常表达也影响免疫细胞的分化、发育和功能。在巨噬细胞中，LncRNAs通过调控免疫相关基因的表达及细胞因子的分泌来影响肿瘤免疫微环境的炎性反应[14]。巨噬细胞可以通过分泌相关细胞因子如TNF-α等来杀伤或抑制肿瘤细胞，THRIL是TNF-α和hnRNPL相关的免疫调节LncRNA。Atianand等[22]研究发现，在单核细胞中，THRIL与hnRNPL的相互作用可影响TNF-α的转录表达，从而影响肝脏中的巨噬细胞KCs的极化。Huang等[23]通过实验研究证实，在M1型巨噬细胞中，LncRNA TCONS-00019715的表达高于M2型KCs，当它被敲低时，M1型巨噬细胞相关标志物的表达降低；M2型标志物高表达，证明TCONS-00019715在KCs极化中起着重要作用。因此，外源诱导的LncRNA表达增加可以将TAM转化为M1型，增强巨噬细胞对肝癌癌前病变恶变的预防和治疗。在肝癌癌前病变微环境中，LncRNAs可通过调控KCs的发育、分化及极化来影响肝癌癌前病变微环境的免疫应答。

LncRNA-ATB是LncRNA信号通路关键调节因子，TGF-β是LncRNA-ATB的激活因子，激活的LncRNA-ATB可促进KCs向M2型极化，并激活HSC。M2型KCs具有促进组织修复和血管生成的功能，并且活化的HSC与肝纤维化的发生密切相关，抑制LncRNA-ATB的表达，则极化为M1型KCs增加，表现为抗肿瘤作用。此外，LncRNAATB与肝硬化发生和HCC血管侵袭呈正相关。姚芳苡等[24]通过体外培养人巨噬细胞发现，LncRNA NEAT1参与KCs极化的调节，在M1型KCs中高表达，高表达的LncRNA NEAT1可有效抑制KCs向M2型极化，并可诱导M2型KCs重极化为M1型。长链非编码RNA E330013 P06的过表达可诱导KCs中IL-6、TNF-α和其他炎症基因的高表达以及IL-10的低表达，从而表现出抗炎和抗肿瘤作用。LncRNA-cox2可介导KCs中不同类别免疫基因的激活和抑制，并在细胞的初级免疫应答中起重要作用。因此，在癌前病变的微环境中，LncRNAs可通过调节KCs的发育、分化和极化来影响癌前病变微环境的免疫应答。

综上所述，多种非编码RNA均可通过调控巨噬细胞的极化方向，通过抑制M2型巨噬细胞极化或促进M1型巨噬细胞极化，发挥减轻肝癌癌前病变细胞形成过程中炎性微环境的形成和杀灭癌前病变细胞，起到抑制肝癌癌前病变恶变的作用。

3 总结

我国是肝癌的高发地区，新发病例占全球的55%左右，尽管目前发展了许多治疗肝癌的方法和技术，如手术切除、射频消融、肝动脉化疗栓塞、三维适形放疗等，但肝癌的复发率及死亡率仍居高不下，即使是根治性手术，5年内仍有超过半数的患者出现复发转移。癌前病变是临床上常见的组织学变化，其向恶性肿瘤进展的风险远远高于其他非恶性组织[25-26]。肝癌癌前病变尚处于可控、可逆的阶段，若在肝癌前病变恶变为肝癌之前找到可靠有效的治疗方法，干预与其发生发展相关的肿瘤微环境，就有可能显著地抑制癌前病变的恶变，从而降低肝癌的发生率[27]。

大量研究证实，KCs的极化与肿瘤微环境密切相关，在不同的微环境刺激下，可向不同的表型极化，从而影响着肝癌癌前病变的恶变。而miRNAs及LncRNAs两种非编码RNA均可通过干预KCs相关细胞因子的分泌或蛋白基因的表达，影响肿瘤炎性微环境成分，调控KCs的极化方向，促进其向M1型极化，从而发挥增强免疫应答、抑制肿瘤生长等作用，抑制肝癌癌前病变恶变。故而，研究非编码RNAs靶向调控KCs极化干预肝癌癌前病变恶变的机制和治疗药物十分重要，期望探索到能有效调控肝癌癌前病变发生发展的非编码RNA，抑制肝癌癌前病变的恶变，降低肝癌的发生率。