红提葡萄灰霉病8株不同生防菌的筛选及鉴定

赵海霞 孟庆月 李 涛

（1银川能源学院化学与生物工程学院；2宁夏伊品生物科技股份有限公司，宁夏 永宁 750100）

由灰葡萄孢菌侵染引起的葡萄灰霉病每年可造成葡萄高达50%的产后损失。用生物防治的手段来控制灰霉病己经逐渐发展成为一条重要且有潜力的防治途径。本研究针对宁夏当地常见的红提葡萄发病的果实中分离病原菌灰葡萄孢菌，并从葡萄根际表面土壤中对灰霉病病原菌的拮抗菌株进行了初步筛选，得到了8株拮抗效果较好的拮抗菌，为红提葡萄灰霉病的生物防治提供有力的菌种支持。

1 材料与方法

1.1 材料

春季对宁夏永宁县小任果业、银川能源学院种植基地、银川市西夏区军马场周边葡萄园和宁夏农业学校葡萄种植基地6个不同地区红提葡萄根际土壤取样，每个取样地采5个样本，将5个点的土壤混匀后，取50mg 3次重复保存共18份样品进行分离。

1.2 方法

1.2.1 葡萄灰霉病病原菌的分离。红提葡萄病果表面用10%次氯酸钠溶液浸泡3min后，无菌水冲洗3次，切取若干块分别接种在PDA培养基上，22℃培养1～2d后，挑选与灰葡萄孢菌形态相似的单菌落，接到新的培养基上培养，直到菌落表现均匀一致为止。将纯化后的灰霉病菌株标记为“JD2016-8”且接种到PDA斜面培养基上，22℃下培养3d后放到4℃冰箱保藏。

1.2.2 葡萄灰霉病菌拮抗菌的分离。称取土壤10g加入90mL充分混匀，制成10-1土壤悬浮液，依次加无菌水稀释制成10-2～10-6浓度梯度系列土壤悬液，分别取200μL涂布于清蛋白固体培养基上，每处理重复3皿。

1.2.3 葡萄灰霉病菌拮抗细菌、放线菌、霉菌以及酵母菌的分离培养和纯化保存。将上述涂布接种完毕的培养皿，倒置28℃恒温培养，2～4d开始挑菌，一直培养10d。细菌分离在培养24～48h开始，将单菌落转接到NA培养基上，纯化培养2次后斜面4℃保存。放线菌分离在培养5d开始，将单菌落转接到高氏一号固体培养基进行平板划线培养，一般纯化培养14d，待生长成熟后终止培养，4℃保存备用。霉菌分离在培养3d开始，将单菌落转接到PDA固体培养基进行平板划线培养，纯化培养2～3次后于4℃保存。酵母菌分离在培养3d开始，将单菌落转接到YPD固体培养基进行平板划线培养，纯化培养2～3次后于4℃保存。

1.2.4 葡萄灰霉病菌拮抗真菌的筛选。将灰霉病病原菌在直径9cmPDA固体培养基上活化，沿菌落边缘用直径5mm打孔器打孔，将菌饼置于空白PDA平板中央。培养皿四周呈“十”字形点接获得的各拮抗菌液（108CFU/mL），距培养皿中心30mm，每处理重复3皿，设不接种菌液的相应空白液体培养基处理为对照。28℃恒温培养7d，观察菌株的抑菌效果，对其在培养基上的菌落形态进行初步的形态学鉴定。

1.2.5 灰霉病孢子萌发和菌丝生长的抑制试验。取葡萄灰霉病孢子悬浮液（106个/mL）20μL，加20μL拮抗菌发酵液，以0.5%葡萄糖液作对照，置无菌洁净载玻片上，28℃培养8h后观察孢子萌发，计算拮抗菌发酵液对病菌孢子萌发的抑制率；取灰霉病菌孢子悬浮液0.5mL加入PDA培养基中。将直径为5mm灭菌滤纸片蘸上发酵液，以无菌水作对照，28℃恒温培养3d后测量抑菌圈直径，计算拮抗菌发酵液对菌丝生长的抑制率。

3 结果

3.1 病原菌的筛选和鉴定

从感染灰霉病的红提葡萄果实表面，分离纯化出1株病原菌，命名为JD2016-8。此菌株在PDA培养基上可以正常生长，生长温度为22℃。菌丝生长初期为灰白色，贴着培养基生长，生长速度较快，5d左右可长满培养皿，显微镜下观察，病原菌分生孢子梗为灰褐色，有隔膜，顶端膨大，其上着生大量分生孢子，形似葡萄穗状，分生孢子为单孢，近圆形或椭圆形，无色或淡色。按照《真菌鉴定手册》，初步确定了JD2016-8为灰葡萄孢菌。

以病原菌JD2016-8基因组DNA为模板，利用真菌通用扩增引物ITS1（F）和ITS4（R）对病原菌JD2016-8进行PCR扩增，目的条带并进行回收纯化测序，该菌的ITS序列测序结果在NCBI上进行比对分析，结合形态特征和ITS序列分析，确定是灰葡萄孢菌。

3.2 拮抗菌筛选结果

经过对所采集的18份土壤样品进行梯度稀释法分离，共筛选得到了64株不同菌株，其中细菌有20株，分离率占31.25%；放线菌有19株，分离率占29.69%；霉菌有15株，分离率占23.44%；酵母菌有10株，分离率占15.63%。采用平板对峙法对分离得到的上述64株不同菌株进行拮抗性复筛，只有8株菌株表现出对灰霉病菌有抑制作用。其中，得到1株高效拮抗菌SW-W8，其发酵滤液抑菌圈直径达25.5mm，其对葡萄灰霉病病菌孢子和菌丝的抑菌率分别为100%和13.17%。在复筛过程中，随培养时间延长，菌株SW-W8对病原菌的拮抗作用几乎不变。

3.3 拮抗菌初步鉴定结果

3.3.1 拮抗细菌：菌株NX-X3、JM-X8、JM-X17均在NA平板上生长，单菌落呈近圆形，边缘整齐，半透明，表面光滑，中间有突起，近白色。革兰氏染色结果表明，该菌株为革兰氏阳性，芽孢呈椭圆形中生，菌体不具抗酸性，可产生异染粒，菌体生长物向四周呈云雾状扩散。综合菌株的形态特征和生理生化特性，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行检索，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。

3.3.2 拮抗放线菌：光学显微镜观察结果表明，菌株NY-F5、SW-F9基内菌丝无横隔，不断裂，气生菌丝多分枝；孢子丝长，顶端呈2～3圈螺旋状，分生孢子圆柱形。初步判断菌株NY-F5、SW-F9菌体形态符合链霉菌属特征，结合形态特征及参照《链霉菌鉴定手册》方法进行，参照《放线菌的分类和鉴定》初步鉴定为链霉菌。

3.3.3 拮抗霉菌：菌株NX-M2、JM-M6通过光学显微镜观察，发现菌丝生长缓慢，初期菌落表面平铺，菌落稀疏，成熟区分生孢子区白色至灰绿色，菌丝无色，壁平滑，顶端不孕菌丝鞭状，粗而长，厚垣孢子形成于菌丝交结处，偶尔在菌丝末端，分生孢子梗簇生。结合形态学特征，参照《真菌鉴定手册》初步鉴定为木霉菌。

3.3.4 拮抗酵母菌：菌株SW-W8菌落为圆形、白色、不透明，表面光滑湿润，中间隆起，边缘整齐，不产生可溶性色素。通过光学显微镜观察菌体形态初步确定为酵母菌。

4 讨论与展望

查阅大量相关文献，灰霉病拮抗菌中拮抗细菌报道相对较多，NX-X3、JM-X8、JM-X17三株拮抗细菌在其他研究中已有大量相关资料；拮抗放线菌NY-F5、SW-F9；拮抗木霉菌NX-M2、JM-M6；拮抗酵母菌SW-W8相关研究资料相对缺少甚至无，对比不同拮抗菌的拮抗性能，下一步进行田间生物防治效果研究工作，并通过分子生物学手段进行菌种鉴定。