猪圆环病毒2型Cap蛋白体外表达技术研究进展

张柱青，吕其壮,2，卓严玲，邓启霞

(1.玉林师范学院 生物与制药学院，广西 玉林 537000；2.广西农产资源化学与生物技术重点实验室，广西 玉林 537000)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，呈二十面体结构对称，能够在哺乳动物细胞中自主复制，为单股环状负链DNA病毒。该病毒是目前所发现的最小动物病毒之一，其基因组大小约为1.7 kb，病毒粒子直径约为17 nm[1]。猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)等多种症候群，引起这些疾病的感染及发展需要许多外部条件，例如环境因素、遗传因素、应激因素、免疫刺激、病原体的共同感染等，但PCV2一直被认为是这些疾病的主要病原[2]。

PCVAD自从20 世纪90 年代开始流行至今，首先以PMWS形式在1991年出现在加拿大，之后接连出现在英国、美国、法国等国家和地区，造成猪的死亡率可高达40%，给世界养猪业造成了巨大的经济损失[3]。此外，猪只单独感染PCV2可能只会引起一些轻微的临床症状，只有当其与猪肺炎支原体、猪链球菌、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原中的1个或多个混合感染时，才有可能会表现出严重的PCVAD症状[4-5]。Cap蛋白是PCV2的主要免疫保护性抗原，也是PCV2的唯一结构蛋白，它常被用作PCVAD诊断的最主要检测对象，同时也是研制PCV2基因工程疫苗的理想靶抗原，因此，体外成功表达出Cap蛋白显得尤为重要。为此，针对近些年有关PCV2 Cap蛋白体外表达技术的研究进展进行了综述，以期为PCV2感染的诊断和PCV2基因工程疫苗的研制提供参考。

1 Cap蛋白概述

PCV2包含11个开放阅读框(Open reading frame,ORF)，各阅读框大小相差悬殊，其中ORF1和ORF2是其中最为重要的阅读框。ORF1与病毒的复制相关，编码Rep蛋白。ORF2编码病毒的衣壳蛋白Cap，全长234个氨基酸，分子质量约为 27.8 ku，与PCV2 特异性中和抗体的产生有关，是病毒主要的免疫原性蛋白，也是研制PCV2新一代检测技术以及PCV2疫苗的研究热点。Cap蛋白的氨基端含有许多碱性氨基酸和精氨酸，Cap蛋白的主要抗原位点和核定位信号(NLS)都位于这些区域，尤其第12—18个氨基酸残基(R-H-R-P-R-S-H)和第34—41个氨基酸残基(H-R-Y-R-W-R-R-K)对Cap 蛋白的核定位至关重要[6-8]。由于ORF2基因较短，它的测序较整个PCV2基因组的测序省力，有利于PCV2毒株的进化分析以及PCV2和PCV1感染的区分。PCV2 Cap蛋白具有高度保守的抗原表位，可以刺激机体产生免疫应答，是PCV2诊断技术的理想靶抗原[9]。当前，国内外许多研究工作如PCV2基因工程疫苗的研发和PCV2感染的诊断等都集中在Cap蛋白，而这些研究工作的开展都离不开Cap 蛋白的体外表达。

2 Cap蛋白体外表达技术

PCV2 Cap蛋白的表达方式多样，如采用大肠埃希菌、酵母、病毒活载体和细菌活载体等表达系统，都取得了比较理想的表达效果。其中，由于表达条件简单，成本低，可用于大批量的重组蛋白表达以及可通过口服途径获得免疫等原因，大肠埃希菌表达系统和酵母表达系统成为目前使用最广泛的表达系统。但是，随着PCV2毒株的不断变异，原先比较实用的Cap蛋白体外表达技术逐渐被新的体外表达技术所取代。近年来，国内外的PCV2流行毒株逐渐变得多元化、复杂化，在传统疫苗的免疫压力下产生了适应性进化[10-11]，其氨基酸序列也发生了突变，导致PCV2检测及预防更加困难，因此，PCV2 Cap蛋白体外表达技术仍然需要不断探索。

2.1 大肠埃希菌表达系统

大肠埃希菌表达系统具有培养方便、周期短、成本低廉等诸多优点[12]。目前，已有许多学者曾尝试利用大肠埃希菌表达系统表达PCV2 Cap蛋白，不管是将Cap蛋白序列截短，还是将Cap蛋白与某些标签蛋白融合，基本都成功表达了Cap蛋白[13]。KONG等[14]将密码子优化后的PCV2 ORF2基因克隆至大肠埃希菌中并诱导表达，表达出的重组Cap蛋白不仅量大，而且具有良好的免疫原性，为PCV2血清学诊断和PCV2相关疾病疫苗的开发提供了参考。赵晓云等[15]利用大肠埃希菌表达PCV2 NJ 株Cap蛋白，实现了Cap蛋白高效可溶性表达，且获得的重组Cap蛋白能够在体外自我组装成病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)并保持良好的免疫原性，为制备PCV2亚单位疫苗尤其是VLP疫苗的制备奠定了基础。目前，国内上市的商品化PCV2亚单位疫苗均是采用大肠埃希菌表达的Cap蛋白与相应的佐剂混合制成，如青岛易邦生物工程有限公司生产的易圆净以及洛阳普莱柯生物工程股份有限公司研制的PCV2 VLP疫苗圆柯欣等，再次印证了利用大肠埃希菌表达系统表达PCV2 Cap蛋白的优势[16]。

2.2 酵母表达系统

酵母表达系统因其培养较方便、简单、成本低廉、产量高、产物易分离、表达的蛋白质活性好、能进行翻译后修饰等诸多优点脱颖而出，成为目前最主要的外源基因表达系统之一[17]。BUCAREY等[18]利用酿酒酵母表达出了经过优化后的PCV2 Cap蛋白，表达产物不仅能够自我组装形成VLPs，而且经口服免疫后小鼠能够产生较高的抗体水平，表明PCV2 Cap蛋白可以在酵母表达系统中表达，而且表达出的Cap蛋白具有很好的免疫原性，可借助酵母系统来研发PCV2的新型口服型疫苗。李中圣等[19]不仅利用毕赤酵母实现了PCV2 Cap蛋白的高效分泌表达，而且对其表达菌进行了筛选，对其表达条件也进行了优化，再次为利用酵母表达 PCV2 Cap蛋白进行疫苗研制奠定了基础。值得注意的是，虽然酵母表达系统有可能会被广泛应用于PCV2 Cap蛋白的体外表达和PCV2疫苗的制备，但目前由于该系统在工业生产时可能会面临蛋白质信号肽加工不完全、易降解等瓶颈问题，所以将来还应慎重考虑是否可将酵母表达技术进行产业化或工业化发展。

2.3 病毒活载体表达系统

活载体通常具有宿主范围广、表达外源基因效率高等优点，因此，目前已有许多国内外学者尝试利用病毒活载体进行PCV2 Cap蛋白体外表达研究。其中以腺病毒、猪痘病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、杆状病毒、黄瓜花叶病毒、λ噬菌体等为病毒活载体的研究相对较多，且取得了许多重要进展。

2.3.1 杆状病毒表达系统 杆状病毒表达系统不仅能够实现外源蛋白的稳定、高效表达，而且不会刺激哺乳动物产生强烈的免疫应答，也不会对它们造成功能性损伤，且杆状病毒是一种极具应用前景的基因工程表达载体[20]。FAN等[21]以杆状病毒为载体在昆虫细胞中高效表达了PCV2 Cap蛋白，表达的蛋白质在免疫小鼠后使其获得了明显的体液和细胞免疫应答，提示重组假型杆状病毒有被应用于PCV2疫苗研发的潜力。YE等[22]利用双重杆状病毒表达系统成功表达了PCV2 Cap蛋白，且表达的蛋白质免疫Balb/c小鼠之后也能够使其产生较强的体液和细胞免疫应答。吴桃芬等[23]利用重组杆状病毒表达了PCV2a和PCV2b双亚型重组Cap蛋白并免疫小鼠，结果发现，免疫过的小鼠脾脏中PCV2基因拷贝数明显低于未经免疫小鼠的基因拷贝数，证实表达出的PCV2a和PCV2b双亚型重组Cap蛋白具有良好的免疫原性，能用于猪圆环病毒新型疫苗的开发。值得一提的是，杆状病毒表达系统中每一次的新蛋白质合成都需要新的宿主，且表达靶蛋白时对技术和工艺水平的要求均较高，因此，其生产成本往往会比较高。如以勃林格殷格翰、英特威/先灵葆雅动物保健公司为代表的国外企业所生产的PCV2亚单位疫苗，均是采用昆虫杆状病毒表达的Cap蛋白制成，虽然对猪有良好的免疫保护效果，但是其价格昂贵，不利于市场推广。

2.3.2 伪狂犬病毒表达系统 伪狂犬病毒载体由于具备安全性好、外源基因容量大、生产工艺简单、原材料来源方便、生产成本低、宿主范围广以及人类对伪狂犬病毒没有易感性等特点而成为极具应用前景的基因治疗载体[24]。CHI等[25]利用重组伪狂犬病毒表达了PCV2 Cap蛋白，表达产物能够自我组装成VLPs且表现出良好的免疫原性。钞安军等[26]也证实，表达PCV2 ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒具有良好的免疫原性并在动物试验中取得良好的效果，再次提示可以采用伪狂犬病毒表达系统研制PCV2 VLP疫苗。鉴于伪狂犬病毒载体不感染人且可以同时插入多个外源基因，有望可以达到1针防治多种疾病的目的。因此，研制能在伪狂犬病毒载体中成功插入PCV2Cap基因且保持载体稳定的技术将是未来PCV2疫苗研制与开发的热点和主要方向之一。

2.3.3 腺病毒表达系统 腺病毒载体因其宿主范围广、外源基因载量大、能有效地将外源基因转染到各种靶细胞或组织中、转导效率高、易于制备纯化、病毒易于包装等特征成为目前细胞试验中常用的基因转移载体之一，且已被广泛应用于基础研究、制药、基因治疗和基因工程疫苗等研发领域[27-29]。郭全海等[30]成功构建了包含PCV2 Cap蛋白中2个特异性表位基因片段的重组腺病毒，经PCR、IPMA、IFA和ELISA检测表明，PCV2 Cap蛋白的这2个特异性抗原表位基因片段能够在HEK-293A细胞中表达，且表达产物与猪抗PCV2阳性血清反应良好，提示重组腺病毒介导表达的Cap蛋白具有良好的免疫原性，可以进一步应用于PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备、PCV2快速检测试纸条的组装以及基于腺病毒的重组PCV2活载体疫苗的研制。尽管腺病毒载体可广泛应用于PCV2疫苗开发、基因治疗等领域，具有良好的应用前景，但由于腺病毒载体本身存在不足之处，如靶向性差、首过效应强、能够诱导机体产生特异性的抗腺病毒中和抗体等缺陷，因此，未来有关腺病毒载体表达系统的研究将主要集中于对该载体的遗传改造和优化等方面。李萌等[29]借助Gibson组装技术发明了一种能够简化腺病毒感染性克隆构建工作的新策略，该策略是一种通过酶切连接结合Gibson组装对腺病毒载体实施定点突变的方法，这为后续需要对腺病毒载体进行反向遗传修饰的研究提供了便利。

2.3.4 猪痘病毒表达系统 痘病毒宿主范围较宽、基因组大、含有多个复制非必需区、可容纳大片段外源基因，是疫苗载体的良好选择，而猪痘病毒因严格的宿主特异性、温和的致病性、热稳定性和低传播力等特点使其备受载体疫苗研究者的青睐[31]。范红结等[32]利用重组猪痘病毒表达出的PCV2 Cap蛋白制备出了免疫效果良好的PCV2活载体疫苗，并成功申请了专利。钟罗华等[33]利用重组猪痘病毒表达的PCV2 Cap蛋白能够与PCV2 Cap蛋白单克隆抗体6E12发生特异性反应，且由该重组猪痘病毒制备的PCV2 灭活疫苗能够与PCV2商品疫苗产生相当的抗体水平，表明猪痘病毒载体表达系统有望被应用于PCV2 Cap蛋白的表达中。然而，虽然痘病毒表达系统可以用于哺乳动物以及人类疾病的防治，且对于免疫低下或患有缺陷的动物是一种理想表达载体，但是鉴于痘病毒各成员间具有的抗原相关性可能会抑制痘病毒科其他病毒的侵入，因此，使用痘病毒载体表达系统表达PCV2 Cap蛋白以制备PCV2活载体疫苗还具有一定的局限性。

2.3.5 其他病毒表达系统 除了以上几种常见的病毒活载体表达系统被尝试用于PCV2 Cap蛋白体外表达外，以λ噬菌体、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、牛痘病毒、黄瓜花叶病毒等为活载体进行PCV2 Cap蛋白表达的研究也在不同的实验室进行，并取得了一定的进展[4,32,34-37]。HAYES等[38]将PCV2 Cap蛋白的优势表位显示于λ噬菌体的表面并免疫仔猪，取得了很好的免疫保护效果，说明λ噬菌体也可以用于PCV2 Cap蛋白的体外表达，更可用于研制PCV2亚单位疫苗。GELLERT等[39]采用重组黄瓜花叶病毒表达出的PCV2 Cap蛋白抗原表位饲喂小鼠和猪后，均能够引起其特定的免疫反应，说明今后利用植物病毒表达PCV2 Cap蛋白并将其用于开发基于植物病毒表达系统的黏膜疫苗具有可行性。

2.4 细菌活载体表达系统

目前，细菌活载体表达系统也是用来表达抗原基因以制备活载体疫苗的常用工具。其中，乳酸菌不仅是安全的口服细菌，而且可以有效表达外源蛋白，因此，常被选为载体来表达抗原成分以制备口服型疫苗。WANG等[40]利用乳酸菌表达的PCV2 Cap蛋白制备口服型PCV2活载体疫苗并免疫小鼠，结果表明，小鼠口服后可产生PCV2特异性抗体，提示用乳酸菌来表达PCV2 Cap蛋白并制备口服型PCV2亚单位疫苗是可行的。此外，KIM等[41]利用支气管败血性博代氏杆菌表达的PCV2 Cap蛋白制备出PCV2活载体疫苗，并将其免疫仔猪，结果表明，被免疫猪体内不仅产生了抗体，而且PCV2病毒载量也显著降低，提示博德氏菌也可以作为载体用于PCV2 Cap蛋白的体外表达及PCV2亚单位疫苗的研发。

2.5 其他表达系统

目前，还没有非常理想的PCV2 Cap 蛋白体外表达系统，已被广泛使用的几种表达系统都存在一定缺陷，因此许多新型PCV2 Cap 蛋白体外表达技术开始出现。如哺乳动物细胞表达系统能诱导蛋白质高效表达，指导蛋白质正确折叠，具有翻译后的加工修饰体系，且表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质，成为了重组药物蛋白质生产的优选系统，被广泛应用于基因工程药物的生产[42-43]。DONG等[44]构建了表达PCV2 Cap蛋白的真核表达载体pVAX-PCV2-ORF2，将其转染BHK-21细胞后，用IFA能检测到Cap蛋白的表达，且以此重组质粒载体免疫小鼠后能够使其产生抗PCV2感染的免疫应答，提示可以应用真核表达系统制备PCV2 DNA核酸疫苗。相比于哺乳动物细胞表达系统，果蝇S细胞表达系统(DES)中的果蝇S2细胞是半悬浮细胞，培育方便，能够产生较高的蛋白质量。因此，DES更有可能成为将来研究 Cap蛋白功能和研制 PCV2基因工程亚单位疫苗的表达系统。马凯凯[45]构建了重组昆虫细胞表达载体 pMT/Bip/V5-HisA-Cap，将其与筛选质粒pCoHygro共转染S2细胞后，表达产物能够与带有V5标签的抗体结合，表明DES能够稳定表达PCV2 Cap蛋白，且表达出的Cap蛋白具有良好的抗原性。

3 小结

PCVAD作为近年来的一种多发性猪传染病，传播方式多种多样，同时还会伴随其他病原的并发或继发感染，大大增加了防治该病的难度，加之PCV2毒株不断发生变异，开发研制PCV2检测方法和预防疫苗显得尤为重要，尤其是基于PCV2 Cap蛋白所研制的PCV2诊断和检测方法以及PCV2基因工程亚单位疫苗。虽然科研人员已经通过原核表达系统以及酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物生物反应器等真核表达系统成功获得了各种PCV2 Cap重组蛋白，但各种表达系统都有其各自的优缺点，例如酵母菌易降解、杆状病毒合成新蛋白需要更换新宿主、腺病毒具有靶向性差、哺乳动物细胞表达系统存在病毒感染的风险等，说明目前PCV2 Cap蛋白体外表达技术仍不成熟，今后还需对以上各种表达系统进行进一步的改造和优化。此外，许多体外表达技术因为申请了专利保护等原因也还没有被广泛使用，这在一定程度上阻碍了PCV2 Cap蛋白体外表达技术的推广和发展。因此，研发更高效、方便、快捷、安全、低廉的PCV2 Cap蛋白体外表达技术将是未来的研究热点和主要方向。