抗菌肽及其在水产养殖业的应用（三）

文/王玉堂

上接2019年3期

六、鱼类抗菌肽在水产养殖中的应用研究

抗菌肽是水生动物先天免疫防御系统的重要组成部分，其在水产养殖业的应用可以提高水产养殖动物机体的免疫能力，增强抗病性，减少抗生素的使用和滥用带来的危害，提高养殖动物产品品质。

（一）作为饲料添加剂的应用

大量的研究表明，在鱼用配合饲料中添加一定量的抗菌肽可以在一定程度上提高养殖水生动物的生长性能、免疫能力和抗病能力，且不同物种来源的抗菌肽对鱼类具有交叉免疫作用。如在饲料中添加100mg/kg鸡β防御素13（Ga1-13）可显著提高罗非鱼的生长性能和抗感染能力；离体模拟试验表明，Ga1-13在低浓度下有显著的抗黏附作用，说明Ga1-13的抗黏附作用可能是促进罗非鱼生长和抗凡隆气单胞菌感染的机制之一。添加150mg/kg和200mg/kg的天蚕素抗菌肽，对湘云鲫有促进生长效果，可提高湘云鲫的溶菌酶活性；添加200mg/kg和250mg/kg时，可使湘云鲫血清中超氧化物歧化酶活性显著提高。但对于抗菌肽能提高养殖对象生长性能的机理还没有确切有确切定论。

目前，有学者认为抗菌肽可以改善动物胃黏膜结构，增强肠道免疫功能，并可杀灭有害微生物，从而有利于动物对饲料营养的吸收利用，促进生长。翟少伟等通过向吉富罗非鱼饲料中添加50mg/kg抗菌肽Surfactin，发现可显著提高吉富罗非鱼的IgM水平、补体C3水平和血清白蛋白质水平，并提高血清溶菌酶活性，明显增强了吉富罗鱼的非特异性免疫能力。

有研究发现，抗菌肽能够耐受颗粒饲料制粒时的高温，在规模化发酵生产抗菌时，通过高温浓缩工序，可充分杀灭菌体而不导致抗菌肽失活，产品应用后不会导致环境生态问题。在饲料中长期添加抗菌肽，细菌不易产生耐药性，无毒副作用、无残留，属一类环保型饲料添加剂。目前，国内作为饲料添加剂生产应用于抗菌肽主要是蚕抗菌肽AD-酵母制剂，大多数试验也都是围绕这种抗菌肽进行的。还没有鱼类抗菌肽商品化的报道，但在试验过程中表现出的广谱性抗菌、抗病毒和抗寄生虫活性展示了其在养殖生产中应用的潜力。Noga等（2009）研究表明，虹鳟鱼头肾表达的具有cathelicidin关键特征的多肽，对多种革兰氏阴性菌的阳性菌具有明显的抑菌活性，其最低抑菌浓度为2μg/mL。因此，寻找各种鱼类内源性抗菌肽，以现代生物技术方法工业化生产这些具有“种属”专一或特异性的抗菌肽产品，将是“后抗生素时代”的一条出路。

（二）作为基因工程药物的应用

抗菌肽具有广谱抗菌效果，且不受传统抗生素耐药菌株的影响，与典型的抗生素具有协同作用。随着对鱼类抗菌肽结构与功能研究的进一步深入，通过基因工程技术实现抗菌肽的体外批量生产，将有可能是解决鱼类养殖主要疾病的新型药物。Chiou等（2009）将中国仓鼠卵巢（CHO）细胞株中生物合成的重组对虾（Penaeus monodon）抗菌肽chelonianin导入罗非鱼体内，发现chelonianin可以有效地控制感染哈氏弧菌的罗非鱼炎症反应，降低了罗非鱼死亡率。

（三）抗菌肽转基因功能的应用

利用基因工程技术培育转基因动物是动物养殖新品种培育的一种途径。借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程技术，把特异性肽基因转入鱼类特定细胞中让其表达，从而产生抗病新品种，将为养殖业发展带来新契机。Sarmasik等（2002）将家蚕肽Cecropins基因导入青鱼将中，结果显示，转基因个体具有比未转导抗菌肽基因对照组更高的抗菌活性。虽然研究抗菌肽转基因动物是获得抗病群体的理想途径，但也面临着周期长和成功率低等诸多问题。

七、抗菌肽在水产养殖业的应用前景

（一）研究开发鱼类抗菌肽的迫切性

近年来，随着工农业生产的发展和城市污水的大量排放，全球性水环境污染日益严重，水环境中的有机物和无机物富营养化、重金属离子和某些难降解的农药等含量已超出水体的自净能力。同时，随着养殖业的快速发展，养殖密度不断升高，养殖动物的排泄物和残饵等积聚量也日益增加，进一步加大了水环境的污染程度，致使水产养殖动物病害频发，给我国水产养殖业造成了巨大损失。为控制水产养殖动物疾病的发生，在防治水生动物细菌性和病毒性疾病过程中大量使用抗生素类药物，不仅破坏了水环境的微平衡，还增强了某些病原微生物的耐药性，严重制约了水产养殖业的健康可持续发展，养殖水产品的药物残留超标事件时有发生，不仅影响到消费者健康，也制约了产品在国际市场竞争力的提升。

因此，加快对主要水产养殖品种免疫防御的基础性研究，调动和开发养殖水生动物自身的免疫能力，是开展健康养殖，实现可持续发展的重要战略之一。水产动物抗菌肽的研究加深了人们对水生动物免疫防御机制的认识，为科学有效防治鱼病开辟了一条有效途径。同时随着转基因技术的发展，有可能通过转抗冻基因等获得抗病新品种。

（二）鱼类抗菌肽的应用前景

与抗菌素的单一作用位点不同中，抗菌肽是作用于细菌的整个细胞膜，使膜去极化或形成“孔洞”，造成细胞内含物外流或肽分子进入细胞内部，与DNA、RNA等靶标作用，进而杀死细菌。除高效杀菌作用外，抗菌肽还具有明显地杀伤真菌、病毒和原虫的作用，并能选择性杀伤肿瘤细胞而不破坏正常细胞，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。由于抗菌肽本身是来源于养殖动物自身的一种小分子蛋白，动物对其的排斥反应很低，而且杀菌作用发挥到一定程度后，动物体内的很多蛋白酶就把抗菌肽降解了，检测不到残留物质，对环境没有任何污染，是一种无毒、无害、绿色、环保的产品。另外，抗菌肽还具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、作用迅速，不易出现耐药性突变等特点，它在水产养殖业中的应用，对提高鱼体免疫力，减少甚至杜绝抗生素类药物的使用，维持鱼体健康，实现水产养殖业的可持续发展具有重要的现实意义。

（三）抗菌肽的制备方法

一般而言，抗菌肽可以通过以下3种途径获得：一是从生物体内直接提取纯化；二是化学人工合成；三是采用基因工程技术构建抗菌肽基因工程株。但由于抗菌肽为体内诱导合成，生物体内的含量较低，从生物体中直接大量地提取难度较大，对技术和成本要求较高，难以规模化生产。而化学合成的方法同样存在成本较高的问题。一般小于10个氨基酸残基的多肽的合成较为经济，10个氨基酸残基以上的多肽合成则很昂贵，限制了应用。因此，利用基因工程方法来生产抗菌肽是一条有效途径。

有关抗菌肽基因的表达研究，最初是在原核表达系统中进行的，但由于抗菌肽对原核细胞有一定的毒性，因此，抗菌肽基因只能以融合蛋白形式在大肠杆菌中进行表达。近年来，以啤酒酵母、毕赤酵母、昆虫等为基因工程宿主进行表达、分离、纯化及应用的研究引起了专家学者的重视，为抗菌肽的开发与应用奠定了良好基础。

（四）抗菌肽的应用效果

近年来国内外的研究结果表明，除游离氨基酸外，动物必须吸收利用一定数量的小肽才能达到最佳生产性能。国内外很多实验证明，在水产养殖中，饵料中添加适量的小肽可增强鱼类的免疫力，提高鱼类的养殖成活率，提高饲料中各种矿物质元素的利用率，提高鱼体内蛋白质的合成能力，促进鱼类的生长。活性肽作为一种新型的饲料添加剂具有广阔的前景。但目前由于相关技术的局限性，活性肽的研究仍处于初步阶段，离规模化生产还有一定距离。

目前，已有越来越多的抗菌肽被克隆出来，品种涉及到鲶鱼、鲑鱼、罗非鱼、比目鱼、斑马鱼等多种鱼类。从报道的序列来分析，它们的组成与结构复杂多样，且没有很高的同源性，但也存在着一些共同特征，如含有较多的精氨酸或赖氨酸而使分子带正电荷；含有较多的疏水氨基酸，可使分子折叠成疏水或双亲性α螺旋结构等。

体外研究表明，许多抗菌肽对鱼类是特异性的，甚至其他动物的病原微生物都具有杀伤活性，其最小抑菌浓度（MIC）多在毫摩尔水平，如鲶鱼和泥鳅抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的MIC为0.5mmol/L～2mmol/L之间；鲈鱼的抗菌肽对杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌等鱼类致病菌的MIC甚至低至1.2mmol/L；此外，虹鳟和鲈鱼的抗菌肽对某些寄生虫也具有致死效力，但其杀伤作用需要较高的浓度，且其活性主要针对滋养体时期。

目前，国内作为饲料添加剂使用的抗菌肽主要是蚕抗菌肽AD—酵母制剂，大多数试验也是围绕这种抗菌肽进行的。黄永彤等发现抗菌肽对鸡有促进生长和提高免疫力的作用，与中草药、抗生素相比，在出栏率、平均个体重量及饲料利用率等方面均无显著差异，在出栏前3天停止投喂，抽检无残留。王广军等（2005）研究了抗菌蛋白在南美白对虾养殖中的应用效果，结果表明，在饲料中添加抗菌蛋白，无论是日生长率、相对增重、饲料系数及成活率、抗病能力方面均有显著提高。此外，因抗菌肽能有效杀灭霉腐微生物，在机体内还可以被蛋白酶降解，双重安全保证使得抗菌肽还可以在饲料工业中作为防腐剂使用。