生殖道沙眼衣原体分子流行病学研究进展

刘兰兰 李武 孙思 张莉 张涛 吕纯芳 陈忠伟 罗珍冑 陈祥生

1深圳市南山区慢性病防治院皮肤性病防治科518000；2深圳市南山区慢性病防治院检验科518000；3中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所 中国疾病预防控制中心 性病控制中心，南京210042

在许多国家，生殖道沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）感染的病例数已超过淋球菌感染，占性病之首。Ct可感染各年龄人群，但主要集中于15～29岁的性活跃人群［1］。Ct感染泌尿生殖道后，约50%的男性和70%（亦有研究显示80%）的女性无症状，或临床症状隐匿，为Ct的防控带来很大的挑战［2］。尽管很多国家开展Ct防治项目（涉及免费筛查、检测，治疗、咨询，性伴通知等），投入大量人力、物力、财力，但收效甚微，Ct发病率仍持续上升。菌株变异、致病机制及传播动力学等有关Ct分子流行病学方面的研究，对于Ct的防治至关重要。

一、分子流行病学

（一）病原学特征：Ct是一类严格胞内寄生、菌体大小介于细菌和病毒之间、可通过细菌滤器的原核细胞型微生物。Ct基因组全长1 042 kb（是大肠杆菌基因长度的1/4），还包含一个隐匿性质粒，基因长度7.5 kb［3］。Ct的主要外膜蛋白（MOMP）由ompA基因编码，该基因长度1.2 kb，由4个可变区1～4和5个保守区组成。可变区基因片段的长度为40～100 bp，其中可变区2是高度变异区，这些可变区穿插在保守区中间。根据可变区序列氨基酸序列的不同，可将Ct分为19种血清型（A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、Ga、H、I、Ia、J和K型，以及L1、L2、L2a和L3）［4］。

（二）分子流行病学技术：宏观横断面流行病学研究可分析Ct在时间、地区及人群中的分布，若了解Ct血清型别的分布、识别基因序列的变异与进化、传播动力学、鉴别治疗失败与再感染等的微观信息，则需通过分子流行病学的方法进行分析。分子流行病学方法主要包括限制性片段长度多态性（RFLP）和ompA基因测序分型等（表1）。

1.RFLP：是基于ompA基因的PCR-RFLP分析而对Ct菌株进行分型的一种方法，其原理是首先用特定的引物扩增ompA基因，然后用限制性内切酶对PCR扩增的ompA基因产物进行酶切。酶切的顺序为：先用内切酶AluⅠ进行酶切，然后用其他内切酶（HinfⅠ、EcoRⅠ、DdeⅠ、CfoⅠ或BstUⅠ）进行酶切，根据酶切片段的长度不同，通过凝胶电泳对Ct菌株进行分型。研究发现，该方法与血型分型结果的一致率达95.0%［5］。PCR-RFLP既不需要对Ct菌株进行细胞培养，也不需要对Ct的单克隆抗体进行纯化，且操作简单，耗时短，因而得到较广泛的应用。然而，RFLP也有局限性，若多种型别同时感染或重组菌株感染，酶切之后，则会产生非典型性、模糊不清的片段。对于这些非典型性条带，需反复酶切鉴定，工作繁重且耗时。此外，RFLP是单位点分型方法，分辨率低，加之ompA基因具有一定程度的变异，因此，RFLP不能鉴别单个核酸的变化。

2.ompA基因测序分型：与其他分型方法相比，ompA基因测序分型具有较高的分辨率，可发现Ct序列中微小的变异，是目前研究Ct分子流行病学的主要方法。随着技术的改进，在ompA基因测序分型的技术上，衍生出两种方法，包括多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和多位点可变数目串联重复序列分析（multilocus variable number tandem repeats analysis，MLVA），这两种方法可识别种群的遗传结构，发现物种的多样性及评估基因型别与疾病之间的关系。

MLST是基于对5个Ct管家基因（hctB、CT058、CT144、CT172、pbpB）进行巢式扩增，然后测序分析，从而对菌株的等位基因进行多样性比较分析。研究发现，与ompA基因分型相比，MLST具有较高的鉴别能力。Klint等［6］用MLST和ompA基因分型方法对47个临床分离的菌株进行分型，结果显示，MLST可发现32种变异型菌株，ompA基因分型仅发现12种变异型菌株。MLVA是基于分析Ct基因组ompA和不同位点可变数量串联重复序列的特征，然后采用聚类分析对Ct进行分型。MLVA分型能更准确揭示Ct聚集特征、菌株起源与变异等流行病学信息。同样，与MLST类似，MLVA的分辨率亦高于ompA分型法。

3.杂交法：虽然MLST及MLVA的分辨率较高，但不能区分混合感染菌株的型别，而杂交法可区分混合感染。目前杂交法有3种，反向线性杂交技术（reverse line blot hybridization）、反向点杂交技术（reverse dot blot hybridization）和微球悬浮芯片杂交技术（microsphere suspension array hybridization）。反向线性杂交技术是将扩增的基因产物与已标记探针的尼龙膜杂交，再与化学发光检测试剂发生反应，反应结束后，会在膜上出现斑点，通过对杂交斑点分析，可进行分型，并可鉴别混合感染，其主要缺点是耗时（1.5 d）。有学者用反向线性杂交技术对Ct进行分型，发现Ct混合感染率为8%～25%［7］。反向点杂交技术与反向线性杂交技术类似，相较于后者，其操作简单且耗时短，不需要特殊机器，结果肉眼可读，还可根据待测标本的数量准备杂交膜的数量，且标本的排放顺序比较灵活。微球悬浮芯片杂交技术也是基于杂交技术，但与反向点杂交技术和反向线性杂交技术相比，不需将探针或DNA产物固定在膜上。该方法操作简单，耗时短且结果易理解，对多重感染具有较高的鉴别能力。杂交技术的主要缺点是分辨率低于ompA分型，且依赖于固定的探针，对于变异的菌株很难鉴别。

4.DNA芯片技术：也称为DNA微阵列，是一种多位点分型DNA（multilocus typing DNA）芯片技术，多位点的选取与MLST的靶区域相同。与MLST相比，多位点分型DNA避免过度测序，快速（96个标本可同时检测）且灵敏度高。研究显示，多位点分型DNA的分辨率是ompA测序的2.4倍，且特异度高达100.0%［8］。多位点分型DNA结果的分析可在1 d内完成，耗时远低于MLST（3～4 d），且数据分析及分型可直接在多位点分型系统中分析。此外，多位点分型DNA设备及耗材的费用较DNA测序低。

5.全基因组测序：由于不同Ct菌株型别之间会发生大量重组，采用ompA测序研究这种重组菌株，其结果并不可靠。全基因组测序可深入了解Ct的进化、变异、多样性及流行状况。全基因组测序需依靠细胞培养，以提供足量Ct DNA，而细胞培养的阳性率较低且培养周期长，使其过程变得繁琐，限制了在临床的广泛应用。近年来，随着免细胞培养技术的引入，可直接从临床标本中提取足量DNA进行全基因组测序。其中一种免细胞培养技术是将MOMP结合抗体附着于磁珠，以从临床标本中分离富集Ct感染的细胞［8］。对于一些商业标本采集管，由于管中的裂解缓冲液会破坏MOMP的结构，因此无法使用该方法。尽管全基因组测序可更全面、更深入的了解Ct，但费用昂贵，且需要技术精湛的专业人员及特殊设备。

二、分子流行病学技术的应用

1.开展分子流行病学调查与检测：全球Ct主要的流行型别为E（30.0%）和F（12.9%），是比较保守的型别，而高度变异的型别是L2和G［9］。Rodriguez等［10］发现，E型不但是主要的流行型别，而且非常稳定，地域间的差异较小。研究表明，大部分感染者是由少数血清型引起，型别在不同人群中的分布存在一定差异。在社区、不孕不育、性病门诊及学生人群中，主要流行型别均是E型，次要流行型别则多种多样。女性性工作者的主要流行型别在不同的研究中不同，如泰国女性性工作者的主要流行型别是F，中国和韩国是E型，匈牙利则是D型。然而，男男性行为者（MSM）人群中常见的流行型别是G、D及J，且D型在无症状MSM的尿道和肛周阳性率较高［11］。若在一个地区发现了新型别，则可能是由于本地人与其他地区的人发生性行为，进而引进新的血清型别。

2.开展临床分子流行病学研究：不同的Ct型别可引起不同临床症状［12］。其中A、B、Ba及C型常见于热带和亚热带地区，主要引起沙眼，经眼-眼或眼-手-眼传播，严重者可影响视力甚至致盲［13］。研究发现，泌尿生殖道标本中亦可检出A型和B型Ct，说明引起沙眼的菌株与引起生殖道感染的菌株之间可能存在重组，导致两组型别之间有交叉感染［14］；C～K型主要引起泌尿生殖道感染［15］；有过孕史的女性较易感染D型［16］。E型感染多无症状，易被感染者忽略，这也是E型是优势菌株的原因，但也有研究报道，E型与异位妊娠及阴道绿色分泌物有关［16-17］。此外，相较于其他型别，感染F/G型的女性较易出现下腹疼痛，但疼痛程度较其他型别引起的下腹疼痛轻［18］。

有报道，E型可引起新生儿结膜炎［14］；L1～L3型通过性接触传播，引起性病性淋巴肉芽肿（LGV）亚种［19］。LGV主要分布于MSM人群，但有研究显示，L2感染与女性盆腔炎有关［16］。

3.鉴别持续感染、再感染与治疗失败：持续感染与治疗失败为Ct的防治带来挑战。研究显示，Ct复发感染在性活跃人群中较常见。2002年，一项Meta分析表明，阿奇霉素1 g单剂口服和多西环素对Ct感染的治愈率分别是97%和98%［20］。另有研究显示，1 g单剂口服阿奇霉素对生殖道沙眼衣原体的治愈率为71.6%，明显低于前者的治愈率［21］。复发的原因究竟是治疗期间的性行为导致的再次感染，还是治疗失败引起，仍然需通过对Ct菌株型别的分型进行鉴定。

4.协助LGV的临床诊断：近年来，LGV在欧洲、非洲、东南亚及北美等国家的报告病例数逐渐上升［22］。LGV具有较强的侵袭性，在MSM人群的肛门-直肠拭子标本中检出率较高，这与其组织嗜性及宿主特殊的性行为有关［8］。荷兰学者在MSM人群中发现新型LGV，将其命名为L2b［23］。随后，奥地利学者也是在MSM Ct阳性者中发现，MOMP的VS1、VS2及VS4区域发生变异的新型别，并将其命名为L2c、L2d及L2e［24］。肛门直肠的LGV感染症状常隐匿或无症状，易被患者忽视，且较难与其他Ct感染型别区分［8］，因此，有必要在MSM人群中开展Ct筛查，并对阳性标本进行分型，以鉴别感染型别及发现LGV新型别。

5.发现变异菌株：2006年，在瑞典发现新型变异菌株（new variantChlamydia trachomatis，nwCT）。之所以将其称为nwCT，是由于该菌株的隐蔽性质粒缺失了377 bp长度的基因片段。当时核酸检测技术的目标引物恰好包含此缺失片段，因此漏检了nwCT，使其迅速在人群中扩散传播。研究显示，nwCT菌株是E型，且多分布于性活跃的年轻人群中［25］。nwCT在其他国家里亦有发现，如墨西哥、丹麦及法国等［26］。目前，尽管在我国尚未发现nwCT，但仍有必要用分子流行病学技术对类似的变异进行监测，以及时采取防控措施。

三、结语

Ct发病率高、流行范围广、危害严重，引起全球公共卫生高度关注。为降低Ct感染的疾病负担，推广Ct感染筛查及分子流行病学分析，采取针对性防治措施显得愈加重要。分子流行病学方法可阐明Ct的临床症状谱，发现变异菌株，识别优势菌株，评估传播动力学，探究菌株型别在不同人群间的分布，鉴别持续感染与新发感染等。这些分子流行病学信息可用于Ct筛查及优化临床治疗方案等，进而为Ct的防治提供分子生物学方面的依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突