疫苗及其在水生动物疾病预防中的应用（七）

文/王玉堂

作者单位：全国水产技术推广总站 中国水产学会

用药指导

上接2018年12期

九、水产用疫苗的使用方法

渔用疫苗是通过接种对象体内产生免疫应答达到预防疾病效果的，因而，有可能因接种对象自身不够健康而不能达到预期的免疫效果。因此，要使渔用疫苗最大限度地发挥效果，平时合理的饲养管理和卫生管理是重要的基础因素。渔用疫苗只有正确使用才能达到预期效果。目前，渔用疫苗的免疫接种途径主要有如下四种：

（一）注射法

目前，国内外渔用疫苗以注射接种法为主。注射免疫接种根据接种部位不同，又可分为皮下注射、肌肉注射和腹腔注射3种。其中腹腔注射接种是弧菌疫苗免疫接种最常用的方法。

鱼类皮下注射难度较大，国内一般采用肌肉注射和腹腔注射。肌肉注射一般采用背鳍基部注射，注射剂量控制在每尾亲鱼0.1mL～0.2mL，方法为与鱼体呈30°～40°，向头部方向插入注射器针头，进针深度约为0.3cm，根据鱼体大小以不伤及脊椎骨而定。采取肌肉注射疫苗一般以易吸收、无佐剂为宜，否则易形成肿块，影响鱼体正常代谢。腹腔注射，将针头沿腹鳍基部内侧进针，斜向胸鳍方向进入，与鱼体呈30°～40°，向头部方向进针，进针深度依鱼体大小而定。有的地区习惯用胸腔注射，从胸鳍内侧基部插入，不过，个体较小的鱼不适用于这种方法。如技术熟练，采用腹腔注射或胸鳍注射法药液不易流出，比肌肉注射效果好。

国内比较成熟的注射用水产疫苗是珠江水产研究所研制的草鱼出血病灭活疫苗，2010年12月获得国家一类新兽药证书（证书号：（2010）新兽药证字51号），2011年3月获得生产批准文号[（2011）190986013]，该疫苗的特点是用量少、效价高、保护力强、免疫产生期快、免疫期长、使用安全方便，克服了组织苗（土法疫苗）效果不稳定和细胞灭活疫苗免疫期短的缺点。主要应用于养殖草鱼的免疫防病，使用浓度为10-2IU/mL，注射剂量0.2mL，免疫时效1年，免疫保护率最高可达100%。

注射法能够保证适量的抗原准确地进入受体鱼体内，具有用量少和免疫效果好的优点，但由于注射免疫需将鱼从池中捞出，费时、费工、增加劳动强度，在大规模养殖情况下不易推广使用。另外，操作人员在注射前应了解鱼体内脏器官的位置，避免在注射时损伤鱼的内脏器官，这也在一定程度上限制了疫苗的推广应用。

（二）浸泡法（喷雾法）

Amend等于1976年首次采用浸泡法进行鱼类免疫接种，并采用组织切片法证实了BSA已经进入鱼体，从而开创了浸泡免疫的先河。随后，Cror和Amend（1977）用稀释的弧菌苗直接浸泡免疫大马哈鱼又获成功。Austin采用浸泡法免疫预防日本鳗鲡弧菌病均获成功。Sakai等报道，用鳗弧菌溶液浸泡免疫虹鳟后，其抗链球菌的LD50提高了12倍。Gould等1978年开始采用喷雾免疫，但直到目前为止，对疫苗进入鱼体的机制尚不了解，免疫原是以可溶性状态还是以颗粒状态进入鱼体内尚存在很大争议。随着对鱼体免疫作用机理的深入研究，会找到更为便捷有效的疫苗给予途径。

影响浸泡免疫抗原摄取的因素有许多，如疫苗的浓度、浸泡时间的长短、鱼的大小、佐剂的使用、抗原存在的物理状态（颗料状或可溶性）、水温等。在这些因素中，抗原的浓度和浸泡时间的长短对于抗原的摄入和保护作用是最为重要的。一般来说，短时间浸泡的方法效果较差。Thume和Plum（2000）用渗浸泡的方法证明BSA的摄取随着浸泡时间的延长而提高，但是，Fender和Amend（2002）则发现，BSA的摄取受到高盐浓度和时间的限制，疫苗浓度和浸泡时间的相互关系是很复杂的，并受到抗原类型的影响。Tatner等（1998）曾对影响浸泡免疫的因素做过研究，采用鳗弧菌疫苗浸泡免疫虹鳟，发现浸泡时间超过10秒钟时，疫苗的吸收量并不随着时间的延长而增加，并且，疫苗的吸收量与温度、鱼体的大小有关。Teruyuki（2002）研究发现了一种新的免疫给予方式，即利用专门的穿刺接种器，使受体鱼在疫苗容器中短时间浸泡的同时，在鱼体两侧进行多孔穿刺处理，2周后感染实验表明，其免疫效果可完全等同于注射免疫。ZHOU等（2000）利用超声波疫苗浸泡免疫青石斑鱼，免疫效果与腹腔注射效果相当，且操作方便。国内外一些科研工作者试图使用佐剂来提高鱼类浸泡免疫效果的研究，发现佐剂能非特异性地增强哺乳动物和禽类的免疫应答的强度和延长免疫应答的时间，但其对鱼类的免疫应答有无影响仍有争议。多数人认为，在注射疫苗中，佐剂能增强巨噬细胞和浆细胞的活性，增加抗体的产生，从而能够增强免疫效果。罗霞等（2007）利用佐剂提高浸泡免疫效果的研究中发现，嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫后，鳜添加佐剂（IMS1312、葡聚糖、莨菪碱、食盐）可以提高鱼粘液及血清中抗体滴度和相对免疫保护率，其中添加IMS1312组的免疫保护效果最好，达77.8%。

浸泡和喷雾方法操作方便，尤其适用于鱼苗的大规模大量接种，成为目前鱼类免疫接种中最常用的免疫方法之一，并逐渐向生产领域推广应用。近年来，中国水产科学研究院珠江水产研究所先后分离并确认了致病性弧菌100余株，提取了6种病原菌的4种亚单位成份，克隆3种亚单位基因并表达，对提取和表达的亚单位成份免疫特性进行了分析。获取的各亚单位成份制备的疫苗免疫保护性测定，浸泡免疫保护率为50%～86.7%。生产性应用试验结果显示：免疫组比对照组提高成活率5%～37.1%，免疫海水鱼类养殖状态更趋良好，普遍呈生长稳定、发病少等特点。

（三）口服法

Duffj首次应用灭活的杀鲑气单胞菌口服免疫硬头鳟获得成功，开辟了鱼类免疫新途径，为控制鱼类微生物感染问题提供了新思路。口服免疫不受时间、地点和鱼体大小的限制，具有方便、省时、省力、少胁迫作用等优点，对鱼体也无伤害。与其它免疫接种方法相比，口服法免疫更适合大规模的养殖鱼群，尤其适用于多次重复免疫操作，不会造成鱼体的应激反应。但对于口服法免疫接种的效果，不同的研究者有不同的结论，有人认为有效，也有人的研究结果恰恰相反。Muroga等（1969）用V.anguillarumPB-15菌株的活菌和经0.01%硫酸亚汞灭活菌苗拌饵对日本鳗鲡每日投喂1次，连续投喂4个月后，用活疫苗对免疫组和对照组日本鳗鲡注射攻毒，结果表明，投喂组显示出了较弱的保护力。这主要是鱼类口服疫苗在实际应用中易被胃肠道蛋白酶的消化，因此，探索一种有效的载体投递系统，能避免蛋白疫苗受胃肠道消化酶及酸环境的影响。采用海藻酸盐、PLGA、PELA等可生物降解高分子材料包裹鳗弧菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌等全菌疫苗，口服免疫虹鳟、鲈鱼、中华鳖、草鱼与银鲫等均获得良好的免疫效果。口服微球缓释疫苗的研究已经开始，鱼用疫苗口服给予途径的研究又有了新进展，其研究方向是，建立一种能在饲料和水生动物胃肠道中保持疫苗抗原稳定性的系统，寻求简单、经济、有效的接种方式。张小江等（2008）采用可微生物降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物（DL-polylactide-copolyethyene glycoLPELA），包裹哈维氏弧菌（Vidrio harveyi，Vh）重组外膜蛋白OmpK后，制备成PELA-OmpK微球，口服免疫斜带石斑鱼后的相对保护率为62.5%，显著高于口服OmpK蛋白组（12.5%）。

目前，英国水产养殖公司（AVL）已开发出Apua Vac抗弧菌口服疫苗和Apua Vac ERM（Enteric Redmouth Disease）口服疫苗。抗弧菌口服疫苗主要用于预防鳗弧菌所致的弧菌病，在希腊已获许可证，为海鲷的提升免疫力疫苗，该疫苗可能对北欧养殖的鳕鱼非常有用，现北欧正在试验。抗ERM口服疫苗主要用于预防鲁氏耶尔森氏菌所致的肠红嘴病。日本预防鰤鱼α，α溶血性链球菌症的灭活疫苗也是通过口服接种，具体做法是：把疫苗充分摇匀后对平均体重100g～400g的鱼体，每日按10mL/kg（体重）的用量将疫苗混合在饲料中，连续投喂5天。我国渔用口服疫苗的研究工作起步较晚，目前还在试验阶段。

渔用疫苗的研究工作正在全世界范围内蓬勃发展，随着生物技术的不断进步和发展，渔用疫苗的使用也呈快速发展势头，因为其安全高效，易于施予，不会引起水产品质量安全问题等。

十、草鱼免疫防控技术概述

草鱼是我国的“四大家鱼”之一，也可谓是我国水产养殖第一鱼，是从南到北、从东到西的主要养殖品种，2015年的养殖产量达568万吨。因草鱼发病严重，且难治愈，本世纪初的草鱼养殖过程中，从苗种到成鱼的成活率只有30%左右。所以，为提高草鱼的养殖成活率，早在上世纪80年代，我国就开始了草鱼疫苗的研制，到2015年前后，我国南方部分省市如广东等在鱼种放养时普遍注射疫苗，已将草鱼的成活率提高到了80%以上。

随着我国第一个渔用疫苗——“草鱼出血病活疫苗（GCHV-892株）”的研制成功，注射疫苗的范围不断扩大，现多个省份推广注射疫苗都取得较好效果。目前我国已应用于草鱼的疫苗主要有：土法组织苗、出血病弱毒活疫苗、出血病灭活疫苗及细菌性烂鳃病、赤皮、败血症三联苗等，但多数疫苗还处于中试和示范应用阶段，尚无明确的使用、操作技术规范等。现以草鱼为例介绍鱼类免疫操作的基本要求、程序及注意事项等。

（一）草鱼苗种的免疫要求

头肾作为草鱼的主要免疫器官，在65日龄后的组织形态发育与成鱼接近，草鱼的体长一般在孵化出膜后的1个～2个月内可长至10cm左右，因此，对草鱼鱼种的免疫注射应在其体长10cm以上的当年或隔年鱼种上进行，且要求鱼种健康，质量符合GB11776—2006标准要求。出现下列任何症状时，均不可进行免疫操作：游泳无力，头部及体色发黑，尾鳍末端发白，口腔、鳃盖、鳍条、肌肉充血，眼睛下陷，鳃丝腐烂，体表局部出血发炎，鳞片脱落，“蛀鳍”，肛门红肿，肠道充满白色的绦虫，肝胆综合症，隐性带毒，未经密集锻炼和消毒，处于“浮头”状态。

（二）疫苗选择、使用与管理

区域使用的疫苗应是经由农业农村部批准的兽药GMP证书的生产企业生产，并通过安全检验合格和有效，包装完整，注有标号、说明、出厂日期和保存期等标识的产品，须符合兽用生物制品质量标准或水产行业质量标准。疫苗瓶标签上应标定可免疫的特定年龄鱼种、免疫途径、一次接种疫苗量等。根据区域流行病学调查确定的病原种类、血清型的检测结果，选择相应的疫苗。当前已上市的疫苗可用于各种养殖场所所养殖的草鱼。

疫苗由其生产单位根据疫苗使用说明书规定的保存温度入库，并按生产批号的前后有序存放，以先进先出的原则发放。各区域根据当地草鱼免疫注射时间提前向疫苗供应单位提交疫苗使用计划，供苗单位根据区域使用计划提供疫苗。疫苗运输途中采用箱壁厚度为3cm～4cm的泡沫箱作为保温包装，内放冰块，保证72小时内到达使用地时箱内温度小于20℃。疫苗的接收单位应仔细检查疫苗外包装是否完好，标签和说明书是否一致，保温箱内温度是否符合要求，疫苗瓶盖是否严密而紧实、无破裂、未过期或污染等。不同剂型的疫苗应在适当温度条件下保存：灭活水剂等保存温度为2℃～8℃，弱毒冻干苗等保存温度-10℃～20℃，同时要避光。在允许的保存期内，草鱼出血病活疫苗应保持疏松的固体状态，嗜水气单胞菌灭活疫苗不应有摇动不散的絮状物或凝集块沉淀，无恶臭或霉变现象。

（三）免疫方法

1.口服免疫

口服免疫的发展相对滞后，目前还处于理论研究阶段，现阶段国内外水产养殖业均没有商业化的口服疫苗应市。口服免疫时，所用疫苗必须是活疫苗，按动物头（只）数计算采食量，停喂半天，然后按实际头（只）数采食量的150%～200%量加入疫苗于饲料中，以保证喂疫苗时，每个动物个体能摄入一定量的饲料，从而获得充分免疫。

2.浸泡免疫法

浸泡免疫是水生动物中鱼类特有的免疫方法，主要针对1龄以内的小规格批量鱼种免疫而推介的生物制品。其原理是通过鱼体皮肤或口服接触疫苗而接受免疫接种，可使苗种产生抗体，增强苗种的群体免疫功能。其特点是使用方便，方法简单，能避免一鱼一针注射的繁琐操作过程。每年秋末至翌年3月初，当水温稳定在10℃～15℃时即可进行浸泡免疫接种，将浸泡疫苗倒入免疫容器中，按说明书要求放入清水，搅拌均匀，并加入少许食盐搅拌均匀，每次按浸泡苗种数量配制疫苗，每条鱼所用的疫苗量以说明书为准；浸泡时间为20分钟～25分钟，浸泡期间需持续充氧，并设专人现场监督，如果鱼苗出现严重应激反应，应马上停止浸泡。浸泡接种后的苗种必须在12℃～18℃水温中饲养20天以上，以提高接种免疫保护率。在浸泡接种过程中，要防止水温急剧上升，使受免疫鱼种发生急性感染而发病。对于用过的疫苗液，可在疫苗液中加入一定量的生石灰或强氯精，浸泡1小时以上来进行无害化处理。

3.注射免疫法

注射免疫法是目前国内草鱼免疫的主要方法，有腹腔注射和背部肌肉注射两种。腹腔注射时，在鱼的腹鳍基部或胸鳍基部腹腔处进针，针头与鱼体呈45度角斜刺入鱼腹，进针深度为0.4cm～0.5cm；肌肉注射时，在鱼有背鳍肌肉处进针，针头与鱼体呈45度角斜向刺入，进针深度为0.4cm～0.5cm。注射免疫操作时，要在池塘中开启增氧机增氧，或将集鱼网箱移到有流水处，以保证有充足的溶氧。注射免疫剂量以说明书为准。在高温季节或鱼较活跃的情况下注射疫苗时，应先将鱼种进行麻醉，一般每次麻醉鱼种80尾左右，在5分钟～8分钟内注射完毕。注射时要摇匀疫苗液，一支注射器只能用于一种疫苗的注射，不得与其它疫苗注射混用或重复使用，吸出的疫苗不得回注瓶内，针筒排气溢出的疫苗应用酒精棉球吸掉。使用过的疫苗空瓶、酒精棉、一次性注射器以及废弃疫苗，应及时进行生物安全处理，用100℃水浴处理20分钟。

（四）免疫前的准备工作

免疫前的准备工作主要有以下几点：一是彻底清塘消毒。可利用冬季干塘捕鱼之机进行彻底的清塘消毒。二是准备接种器械和药品。洗净并消毒塑料盘（直径60cm）、捕鱼网、盛鱼盆以及注射器、针头、疫苗稀释瓶等所有器具（高压灭菌或水浴蒸煮消毒20分钟）；准备盐酸丁卡因或含量90%的晶体敌百虫作为鱼体麻醉剂（也可用其它麻醉剂），2%～3%食盐水或用10mg/L漂白粉加8mg/L硫酸铜作为鱼体消毒剂；一般选用连续注射器，以减少注射器加液的麻烦，为防止进针太深而伤及鱼体，可将针头磨短至0.5cm～0.6cm，或在针头根部套上一小截塑料管而只露出0.5cm～0.6cm的针头；体长10cm～13cm的鱼种可选用5号针头，体长17cm以上的鱼种应选用6或7号针头。三是待免疫苗种的选择。待接受免疫的草鱼苗种应为健康苗种：体色正常、体型较好、无病无伤、游动活泼、规格均匀，并应抽样检查无特定病原。苗种选择好后，在注射免疫前1天投喂日投饵量的50%，第2天停食，第3天拉网锻炼，第4天在拉网锻炼后移入集鱼网箱中，适当密集1小时～2小时，用2%～3%的食盐水浸浴5分钟或用10mg/L的漂白粉加8mg/L硫酸铜溶液药浴10分钟～20分钟，以杀灭鱼种体表的细菌和寄生虫等，具体浸泡消毒时间应视养殖种类、水温高低、药物浓度、苗种体质等而灵活掌握。四是稀释疫苗。按说明书要求配制，疫苗宜现配现用，剩余疫苗不再使用。五是麻醉鱼种。鱼种接种疫苗前要先将鱼种麻醉。

（五）免疫接种

草鱼是变温动物，免疫应答在水温10℃以下受到抑制，对疫苗的免疫临界温度在10℃。在免疫临界温度以上，免疫应答随水温的升高而增强，但当水温超过32℃，其应答反应反而下降。因此，草鱼的免疫适宜温度为10℃～28℃。生产上一般选择在鱼种放养时进行免疫操作，此时的水温约为10℃～28℃，较为适宜，但活疫苗要求10℃～20℃的水温环境。高温季节免疫时，要选择在清晨及通风、阴凉处进行。

草鱼出血病活疫苗（GCHV-892株）一年免疫接种一次即可，而嗜水气单胞菌灭活疫苗、草鱼出血病灭活疫苗根据产品说明书使用，组织浆疫苗一般一年接种2次～3次。免疫操作按说明书进行。

（六）免疫后管理

免疫后的管理工作主要有以下几点：一是免疫后观察与放养。免疫接种后30分钟内，应注意观察鱼种的活力、状态等有无异常。免疫注射后的麻醉鱼种要暂养于池塘中的网箱内，等鱼种复苏恢复游泳能力后方可放养，不得在注射免疫操作的池塘边放养。注射免疫后的鱼种停食1天，并将待放养鱼种的池塘消毒1次。二是科学投喂，鱼种放养后，按“四定”原则投喂。三是做好水质管理和调节工作。四是及时杀灭寄生虫。五是认真做好日常工作管理工作。