急性肝胰腺坏死病试验方法的研究进展

彭张明，蒲桂川

（海南海壹水产种苗有限公司，海南 海口 571126）

对虾的急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）是近年来出现的一种新型致命性、细菌性疾病，该病最初被称为早期病死综合征（EMS）和急性肝胰腺坏死综合征（AHPND）[1]。国内外对该疾病的发生、流行病学、病原学、耐药性、易感物种、临床体征、组织病理学、预防、治疗和诊断等重要信息做了大量研究，使人们更进一步认识了该疾病。该文主要从目前已开展的AHPND病原研究、AHPND试验处理及AHPND致病性生物测定3个方面内容出发，进行AHPND有关试验方法的综述，以期为进一步研究AHPND和其他虾类疾病提供潜在的指导方向。

1 急性肝胰腺坏死病（AHPND）病原研究

1.1 AHPND发生与流行

AHPND的暴发通常在放苗或室外标粗约35 d左右，严重时10 d左右便会发生，病死率达到40%～100%[2-3]，该疾病最先导致了2009年中国[4]、2011年越南和马来西亚、2012年泰国[1]、2013年墨西哥[5]、2015年菲律宾[6]和2016年南美洲[7]等养殖区域的对虾大量病死，亚洲对虾养殖每年因AHPND造成的生产损失估计高达10亿美元[1]。2011年上半年造成我国海南、广东、福建和广西80%对虾养殖场发病[8]，中国的对虾养殖产业规模大，养殖环境更是复杂多样化，AHPND的爆发范围也极其广泛，未来该疾病仍会长期影响中国的对虾养殖业的发展。此外，该病通常在高温干旱季节的高盐、高碱养殖池中具有较高的发病几率[9]，据报道斑节对虾（Penaeus monodon）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）和中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）都是AHPND的易感种群[1-2，10]。

1.2AHPND致病原

Tran等[11]成功确定了满足柯赫假设的AHPND致病原（VpAHPND），一株革兰氏阴性杆状毒株，嗜盐海洋性副溶血性弧菌（V.parahaemolyticus），但与已知的副溶血性弧菌分离株的基因不同[12]，这种新菌株携带一个或多个染色体外的70 kbp左右质粒（pVA1），该质粒可编码与光杆菌同源的昆虫相关致命二元毒素（pirAvp和pirBvp），从而表现出高致病性[13]，因此不是所有副溶血弧菌都表现出AHPND致病性。然而，通过基因组测序发现，一些非副溶血性弧菌属的AHPND致病原也被确定携带pVA1-like质粒，如哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、欧文斯氏弧菌（Vibrio owensii）和坎贝氏弧菌（Vibrio campbellii），因此，在某些情况下，AHPND可能不单是由副溶血弧菌引起，甚至其他弧菌属也能引起[4，14-16]。

1.3AHPND诊断方法

1.3.1 AHPND临床体征 对虾早期感染AHPND的一系列体征包括：嗜睡，厌食，生长缓慢，肝胰腺发白、明显的萎缩（50%或50%以上），甲壳变软、易被剥离，空肠空胃，用拇指和食指不能轻易碾碎肝胰腺，垂死的虾沉底等，这些临床体征和死虾可以最早在放苗10 d内观察到，在疾病的末期，肝胰腺会出现黑色条纹或斑点[4，17-18]。

1.3.2 AHPND组织病理观察 AHPND组织病理观察仅限于对虾消化系统的肝胰腺，通过观察可发现患病对虾肝胰腺出现大面积坏死，肝胰腺盲管从中段到末端发生变性，盲管上皮细胞坏死、脱落，细胞核肿大，分泌细胞（B cells）、高嗜碱性细胞（F cells）和脂肪储存细胞（R cells）的细胞数量减少、退化及功能紊乱，胚细胞（E cells）有丝分裂能力显著降低，在后期肝胰腺盲管间或盲管内发生血细胞浸润，进而肝胰腺出现继发性细菌感染，最终疾病末期完全被破坏[11，19]。

1.3.3 AHPND的PCR诊断 亚太地区水产养殖中心网络（NACA）最早公布的AHPND一种PCR诊断方法是质粒（pVA1）序列为靶点的两条引物[20]，Tinwongger等[21]向外界公布了第一种以100%准确率靶向AHPND毒素pirAvp基因的一步式PCR方法，Dangtip等[22]引入了同时扩增pirAvp和pirBvp基因的增强型嵌套两步PCR方法，Han等[23-24]先后引入了扩增pirAvp和pirBvp基因的双重PCR方法以及可检测和定量AHPND致病菌株编码pirAvp毒素pirAvp基因的TaqMan定量PCR（qPCR）方法。此外还出现了用于AHPND致病菌株的现场检测的三环介导等温扩增技术（LAMP）方法，以及多种病原检测的多重PCR方法[25-26]。

2 急性肝胰腺坏死病（AHPND）试验处理方法

2.1 AHPND样品处理

AHPND是一种细菌性疾病，根据目前PCR检测方法的有效性，该致病菌株可以确定普遍存在虾、池塘水、沉积物、饲料、藻类、粪便、虾苗及亲虾促熟时饲喂的活饵中，因此以上样品都是适宜于AHPND检测[27]。AHPND致病菌株经口转移并定植虾的消化系统中，释放毒素，随后损害消化腺或肝胰腺，因此，与虾消化系统相关的组织和器官，如肝胰腺、胃、中肠和后肠，是最适合诊断AHPND的样品，其他组织和器官也可以根据特定研究的目的进行特定的试验[10]，此外检测样品最好是现取、活的，若是用于分子试验，样品可以固定在100%乙醇中[28]。

2.2 AHPND样品菌株分离与保存

进行样品菌株分离时，要对样品表面无菌处理、粉碎并单独接种到用于分离副溶血性弧菌的肉汤或其他培养基中，例如碱性蛋白胨培养基（APW）、1.5%～2.5%氯化钠胰蛋白酶大豆肉汤（TSB+）或胰蛋白酶大豆琼脂（TSA+）、TCBS琼脂及科玛嘉弧菌显色培养基等[3]。AHPND致病菌株在TCBS和科玛嘉弧菌显色培养基上分别表现为绿色和淡紫色菌落，接种的培养液和琼脂平板可在室温或28～35℃（最好与养殖和取样虾的水温相同）培养18～24 h[3,5]。分离纯化后的菌种必须种到含有TSB+的试管中（1%～2%氯化钠），加入10%～50%的甘油，并保存在-80℃超低的冰箱中，若要使用可将菌种部分解冻，再接种到适当的培养基中，或在适当的琼脂培养基上划线，以确定其纯度[3,22]。

2.3AHPND细菌富集与DNA提取

将肝胰腺、胃、粪便、虾苗和环境物质等样品进行初步细菌富集，可以在TSB+中接种，然后在30℃左右连续摇动培养4 h，培养后的样品放置一段时间，让所有碎片沉淀下来，通过离心分离去除混浊上清液，以获得用于DNA提取和PCR检测的细菌颗粒，从而得到更强的PCR谱带[29-30]。DNA的提取可使用常用DNA提取方法或商用DNA提取试剂盒，例如利用沸腾法粗提取细菌基因组DNA，是在含有3%氯化钠的心浸液（HI）琼脂平板上在30℃下培养细菌过夜，然后将一个菌落接种到50 uL无菌蒸馏水中，在95℃下加热2 min，然后离心1 min，然后收集上清液进行PCR反应[21]。

2.4 AHPND菌株鉴定与基因组测序

通过鸟枪测序法对从感染AHPND的虾身上扩增出的细菌小亚基核糖体DNA基因（ssrDNA）片段进行测序，结果表明，AHPND致病菌株的序列与感染其他弧菌的患病虾身上常见的序列不相关[31]。随着全世界范围内对AHPND研究的不断深入，不同区域、不同类型的AHPND致病菌株信息被上传到DDBJ/GenBank/PubMLST数据库中。从越南、泰国、墨西哥和拉丁美洲等地受AHPND感染的养殖场得到并确定，在一些副溶血性弧菌菌株中，存在两大类pirAvp和pirBvp基因缺失和突变的类型，I型突变体是pirAvp和pirBvp基因全部缺失，标记为pirABvp(－)，Ⅱ型突变体是小部分缺失，即包含pirAvp基因以及部分pirBvp基因，标记为pirAvp(－)。实验室通过对AHPND突变菌株致病性的生物测定试验，结果显示该菌株对虾没有致病性，因此证实了AHPND致病性菌株需要pirAvp和pirBvp基因[32]。

3 急性肝胰腺坏死病（AHPND）致病性生物测定

3.1 AHPND致病菌株与试验动物准备

将AHPND致病菌株接种到合适的肉汤培养基（如TSB+和APW）中，以进行AHPND致病性生物测定，试验的菌群密度必须要达到约2×108CFU/mL，是已经被证明可导致高病死率和明显AHPND病理特征的密度[3]。在试验处理前，试验虾须在相同的实验池中一直在良好的条件和适当的密度下驯养，虾必须以大约12 h的间隔以10%的生物量的水平喂食（Nunan等），每次进食2 h后，必须将未食用的饲料全部从水中捞出[11,27]。

3.2 AHPND浸泡试验

浸泡是检测细菌毒性最适合的方法之一，NACA也建议用这种方法来进行AHPND生物测定试验，它已经揭示了AHPND可通过浸泡进行感染，可导致100%的病死率，并伴有典型的AHPND病理特征[3]，贾丹等通过患病中国明对虾体内分离出一株副溶血弧菌，经过急性浸泡感染试验，18 h病死率高达到100%[33]。

3.3 AHPND反饲试验

反饲，也被称为改良灌胃或强制喂食，是通过将含有传染性物质的悬浮液通过虾的肛门进入前中肠区域以及其与肝胰腺的连接处，用极少量的细菌引起感染，故不太可能对虾造成创伤。将30 mL的含AHPND致病菌株（约2×109CFU/mL）的TSB+肉汤培养液，在28℃下培养18 h后，再以6 000转/min的速度持续离心5 min，得到的上清液通过0.2 μm的过滤器过滤后进行反饲实验，试验虾与浸泡实验的虾都出现了相似的AHPND组织病理损伤，这些结果表明，无细菌的上清液能够通过反饲处理后诱导试验虾的AHPND病理，反过来可以为推论AHPND病变是由细菌毒素引起提供初步证据[3]。需要注意的是，接受反饲处理的虾在传染性物质给药前至少6 h内不得进食，以确保其中肠是空的[27]。

3.4 AHPND口服试验

在养殖过程中有害病原主要是通过对虾的摄食进入体内，经过消化系统后在肝胰腺及肠道内进行大量繁殖，这是养殖过程中引起对虾感染疾病的主要途径之一。通过口服方式进行AHPND致病性试验可以最大程度的还原及模拟对虾获取致病原的过程，能够最有效体现导致感染的自然途径[34,13]。在越南投喂冷冻的AHPND感染虾体作为致病原，结果是实验虾未能产生与AHPND一致的肝胰腺病理体征，可能是由于经冷冻处理后的感染虾体，其致病菌的含量骤降、失活以至不能被检测到[3]。但是在墨西哥将颗粒虾饲料与在TSB+中的致病菌（约2×108CFU/mL）混合 10 min 后，进行过夜培养，将处理过的颗粒给虾摄食，诱导了试验虾体内出现AHPND病理体征[5]。同样要注意的是，虾在试验之前，至少6 h内不得摄入任何食物[27]。

3.5 AHPND肌肉注射试验

对虾腹部肌肉注射进行毒力研究早已大量运用，由于这种方法能诱导发生自然细菌性疾病，例如虾的表皮损伤、蜕皮或自然菌群失调，因此肌肉注射不推荐作为确定AHPND致病性的方法。黄志坚等[35]通过向对虾腹部肌肉注射副溶血弧菌引起健康对虾得到AHPND的典型症状，另外一个研究是，在试验虾的第三腹节进行肌肉注射50 μL从感染AHPND虾分离的弧菌菌液（103CFU/虾），在注射后6 h内确实造成高病死率，通过肝胰腺组织病理分析发现，肝胰腺小管上皮细胞部分塌陷成未分化的细胞，却没有细胞大量脱落的特征，因此，虽然该菌株对虾具有高致病性，但通过肌肉注射不会引起AHPND 病理[36]。

4 总结与展望

AHPND是一种全球性、全世界范围内的对虾传染性疾病，造成了对虾养殖产业巨大损失，对整个产业都构成了大的威胁，这一事实也使得对该疾病的生物监测、诊断和管理必将成为一个更大的挑战。据报道这种疾病是通过从AHPND池塘的共生或水诱导健康虾发生，然而，迄今为止还没有详细、合适的感染途径开展共生传播试验的模型[1，36]，今后可能还要根据其他虾类疾病的共生传播模型开展设计及修改。此外，包括AHPND致病菌株的耐药性及食品安全问题，研究AHPND病原实验室的生物安全和生物安保原则，AHPND疫病防控的生物安保理念推广[37]等方面都要大力推进，以降低病原对水产养殖系统的传入、定植和扩散的风险，形成水产动物健康养殖管理、技术和设施上执行的一整套措施，保障水产健康养殖产业的可持续发展。