基于高通量测序的生物炭施用量对植烟土壤细菌群落的影响

任天宝，杨艳东，高卫锴，李宙文，阎海涛，王省伟，刘国顺

(1.河南农业大学/河南省生物炭工程技术中心，河南 郑州 450002； 2.广东中烟工业有限责任公司，广东 广州 510000; 3.河南省烟草公司郑州市公司，河南 郑州 450000)

生物炭(Biochar)是指作物秸秆、木质物质、禽畜粪便等含碳量丰富的生物质在无氧或限氧的条件下经过高温(350～700 ℃)热解而形成的富含有机碳的物质，将其施入土壤，可以增加土壤有机质或腐殖质的含量[1-5],进而影响土壤的生物活性和理化性质，如土壤pH值、阳离子交换量(CEC)、容重、孔隙度和含水量等[6-12]，这些理化性质又将会影响微生物活性和微生物群落结构。生物炭还具有改善微生物细胞的附着性能、促进特定类群土壤微生物栖息和生长的作用，并且能够改变土壤养分的生物有效性等。土壤微生物被视为陆地生态系统中的主要分解者，在构建自身生物量获取资源的同时，可促使生态系统中物质转化和能量流通，同时调控养分与碳在土壤-植物-大气之间的平衡与循环，进而对土壤生态系统的功能和结构产生影响。已有研究表明，生物炭可以改变土壤微生物群落组成、丰度、活性及多样性等[13-17]。顾美英等[15]研究施用生物炭对新疆石河子垦区灰漠土和风沙土土壤养分和微生物多样性的影响发现，施用生物炭后灰漠土和风沙土根际土壤细菌和真菌数量均增加,根际土壤细菌数量分别提高2.2%和72.1%，真菌数量分别提高80.0%和83.3%。陈泽斌等[16]研究生物炭不同施用量对烟草根际土壤微生物多样性的影响发现，在生物炭施用量为50～150 g/棵时，随着生物炭施用量的增加，根际土壤细菌种类的多样性和分布的均匀程度均提高。陈懿等[17]研究表明，施用生物炭可以增加植烟土壤微生物数量。

一般而言，土壤中可进行平板培养的微生物数量仅占0.1%～1.0%[18-19]，传统培养所得到的微生物群落信息极小[20]。土壤微生物非培养研究方法，如DNA指纹图谱技术、磷脂脂肪酸分析法以及微阵列基因芯片等方法虽然克服了培养技术的一些缺点[21]，但是这些方法与第2代测序方法相比，仍有通量低和信息量小的缺点[22]。第2代测序方法以Illumina公司的Solexa，Roche公司的454，Life Technologies公司的SOLiD、IonTorrent为主[23-24]。这些测序平台具有快捷、价格相对较低、数据产出通量高等特点，在土壤微生物物种、结构、功能和遗传多样性的研究中可以获得大量的信息[25]。为此，以湘西山地植烟土壤为研究对象，采用Illumina Miseq测序技术对土壤细菌群落结构进行分析，以期为生物炭改良山地土壤生物学特性提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验地概况及试验材料

试验于2016年2—7月在湖南永顺县松柏镇广东中烟基地单元核心示范区进行，试验田地处亚热带季风气候区(108°21′～116°07′E、29°05′～33°20′N)，四季分明，雨热同季。全年日照时间为1 100～2 150 h，年平均气温为15～17 ℃，无霜期为230～300 d，年降水量约为580 mm。供试土壤为黄棕壤。供试烤烟品种为K326。试验地土壤含碱解氮59.71 mg/kg、速效氮91.51 mg/kg、速效磷23.11 mg/kg、速效钾157.65 mg/kg，pH值为5.4。

生物炭由河南省生物炭工程技术研究中心提供，原料为花生壳，在350 ℃条件下炭化4 h制成，其含全碳71.50%、水分9.00%、总氮1.9%、总磷3.00%、总钾0.8%,pH值为8.5。

1.2 试验设计

试验设置5个处理：OEE(原生态土壤，取自未耕作过的土地)、CK(生物炭用量为0)、T1(生物炭用量为0.75 t/hm2)、T2(生物炭用量为1.5 t/hm2)和T3(生物炭用量为2.25 t/hm2)，每个处理重复3次，小区面积为25 m2。烟苗于2月10日移栽，种植密度为16 500株/hm2，2月5日将生物炭在起垄之后施入垄台之上，施肥方式为穴施，施肥点距离烟株15 cm，所有处理水肥管理与大田管理一致。

1.3 土壤样品的采集

在烤烟采收完毕后(2016年8月5日)进行土壤样品(根系土)的采集。按照5点取样法分小区进行采样。采集时先除去地面植被和枯枝落叶，铲除1 cm左右的表土，再进行0～20 cm耕层土壤采集，混匀后采用四分法保留1 kg土壤样品装入已灭菌的牛皮纸袋中，立即放入4 ℃冰盒中保存。将冷藏土样带回实验室后，剔除植物残体、较大的土壤动物及石头等，再迅速过2 mm筛。然后在-80 ℃条件下保存，用于土壤细菌16S rDNA 序列的测序分析。

1.4 土壤总DNA的提取及16S rDNA序列测定

参照Omega公司的D5625-01 Soil DNA Kit土壤基因组DNA提取试剂盒的说明书提取土壤样品DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检查后，用无菌水稀释至1 ng/μL。

使用带标签序列的ITS2 区及16S rDNA-V4 区特异引物3F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)、4R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)和515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806R( 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，使用KODPlus-Neo高保真酶进行PCR扩增，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海美吉生物信息科技有限公司进行测序。

1.5 下机数据的质控及分析

剔除标签序列和引物序列，用FLASH 软件[26]进行序列拼接，经Qiime软件[27]过滤后与Gold database 数据库中已知序列进行比对，再用UCHIME 软件[28]去除嵌合体序列，得到有效序列。用Uparse软件[29]在97%的相似性水平上划分操作分类单元(OTU)，代表序列用RDP Classifier 软件[30]和Green Gene 数据库[31]进行物种注释。利用Mothur软件作稀释度曲线。采用R语言绘制样品OTU的韦恩图、PCA图、多重比较图和热图。

参考Kim等[13]的方法分析细菌Alpha多样性，其评价指标主要包括Chao1、覆盖度和Shannon指数等。其中，Chao1在生态学中常用来估计物种总数；覆盖度是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低；Shannon指数是用来估算样本中微生物多样性的指数之一。

2 结果与分析

2.1 生物炭施用量对湘西山地植烟土壤细菌物种组成的影响

由图1所示，不同处理土壤样品中公有OUT为1 483个，占总OTU数的8.69%。施用生物炭的T1、T2、T3处理与CK土壤样品中公有OTU分别为2 773、2 556、2 734个，表明随着生物炭施用量的增加，生物炭处理与对照处理中细菌种类的相关性呈现先降低后升高的趋势，这可能是因为生物炭改善了土壤物理结构和微环境，为细菌生长提供了更多的生存空间和资源，从而促进了细菌的生长发育[32-33]。OEE土壤样品中，与CK土壤样品中公有的OUT占31.98%，表明长期施用化肥会对农田细菌物种组成造成明显影响。

图1 不同处理土壤细菌OTU分布

2.2 生物炭施用量对湘西山地植烟土壤细菌多样性的影响

由表1可以看出，细菌Chao1值随生物炭施用量增加先降低后增加，与OEE相比，生物炭处理细菌Chao1值均明显提高，但均低于CK；覆盖度随生物炭施用量增加先增加后降低，生物炭处理的覆盖度均高于CK，但均低于或者等于OEE；Shannon指数随生物炭施用量的增加先降低后增加，生物炭处理的Shannon指数均低于CK，且仅T1处理高于OEE。推测生物炭的施入可能改变了土壤的基本理化特性，提高了土壤的通透性，进而影响了土壤中厌氧环境条件下的细菌多样性，致使多样性指数降低。

表1 不同处理土壤细菌Alpha多样性

由图2可知，主成分1(PC1)与主成分2(PC2)对土壤样品的贡献率分别达到62.16%和14.41%。此外，OEE、CK土壤样品均位于PC1的负值区域，分别位于PC2坐标轴负、正两侧，说明这2组样品间的主成分变异显著；T1、T2和T3处理样品均位于PC2坐标轴附近，对PC2的贡献表现为T2和T3处理间差异不明显，但均大于T1处理，这也进一步说明了生物炭对土壤样品细菌群落有明显影响。总体而言，施用生物炭影响了土壤细菌种群结构，且随生物炭施用量的增加，该影响程度随之增加。

图2 不同处理土壤细菌群落结构主成分分析

2.3 生物炭施用量对湘西山地植烟土壤细菌群落结构的影响

由图3可知，对各处理中优势细菌变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、螺旋体菌门(Saccharibacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)进行丰度分析表明，酸杆菌门和绿弯菌门在各处理间的群落丰度均达到了显著水平(P<0.05)，而其他菌门群落丰度在各处理间差异均达到了极显著水平(P<0.01)。施用生物炭处理变形菌门群落丰度显著高于OEE(P<0.05)，而这种程度随生物炭施用量的增加而增加，与CK相比，仅T3处理的变形菌门群落丰度提高。施用生物炭处理酸杆菌门群落丰度随生物炭施用量的增加而降低，均低于OEE和CK，OEE酸杆菌门群落丰度最高。施用生物炭处理放线菌门群落丰度随生物炭施用量的增加呈先降低后增加的趋势，均高于CK、低于OEE。施用生物炭处理绿弯菌门群落丰度随生物炭施用量的增加而降低，均高于CK，仅T1处理高于OEE。施用生物炭处理芽单胞菌门群落丰度随生物炭施用量的增加呈先降低后增加的趋势，均高于OEE，T1、T3处理均高于CK。施用生物炭处理螺旋体菌门群落丰度随生物炭施用量的增加呈先增加后降低的趋势，均高于OEE，仅T2处理高于CK。施用生物炭处理装甲菌门群落丰度变化趋势与螺旋体菌门相似，也随生物炭施用量的增加呈先增加后降低的趋势，均高于OEE和CK。综上，与CK相比，生物炭施入植烟土壤后，对放线菌门、绿弯菌门、装甲菌门群落丰度有明显的促进作用，而对酸杆菌门群落丰度有一定的抑制作用。

图3 不同处理土壤优势细菌门水平上相对丰度分析

由图4可知，随着生物炭施用量的增加，各处理细菌优势菌门组成相似度增加，这表明施用生物炭可以促使细菌种群朝特定方向改变，而这种改变程度与生物炭施入量有关。OEE与其余处理的细菌优势菌门组成相似度低，生物炭处理之间细菌优势菌门组成相似度较高，与OEE细菌优势菌门组成相似度较低，与CK细菌优势菌门组成相似度较OEE高,但较其余生物炭处理低，说明经耕作后的土壤细菌群落组成会发生较大改变。各处理中变形菌门与其余菌门相似度低，而芽单胞菌门与螺旋体菌门、放线菌门与绿弯菌门的群落组成相似度较高。

用颜色梯度表示物种所占比例的大小，颜色越深说明该物种所占比例越大图4 不同处理土壤细菌优势菌门组成及聚类分析

3 结论与讨论

本研究对土壤细菌群落结构分析发现，与CK相比，生物炭施入植烟土壤后，对酸杆菌门群落丰度有一定的抑制作用，这与姚钦[27]的研究结果一致，因为生物炭呈碱性，施入土壤中不利于酸杆菌门细菌的生长；对放线菌门、绿弯菌门、装甲菌门群落丰度有明显的促进作用，这可能是因为生物炭的多孔性，为细菌在土壤中生长及繁殖提供了更多的空间，从而增加了细菌的数量，同时还调节了土壤环境的物理和化学性质，影响土壤微生物生长、发育和代谢[28]。本研究通过PCA分析发现，生物炭可以促使土壤细菌群落结构向特定的方向发展，在这种发展的同时，相对于CK，生物炭处理的细菌多样性有所降低，这可能是因为土壤细菌对土壤酸碱度和有机质含量较敏感[29]，同时对土壤物理特性(土壤容重、含水率、温度)依赖性也较强[30]。陈温福等[31]研究表明，生物炭能够有效增加土壤pH值，同时会增加土壤有机质含量。王欢欢等[32]研究表明，生物炭能够改善土壤物理特性，降低土壤容重，提高土壤孔隙度。所以，当生物炭改变土壤基本理化性状后，细菌为适应土壤的改变而改变自身的群落结构[33]，导致适应性较强或喜好这种改变的细菌菌群得以保留和发展[34]。通过聚类分析发现，相对于与OEE相比，生物炭处理与CK的细菌群落结构有着更强的相似性，这可能是因为CK也是经过人类长期改造的耕作土壤，生物炭处理也是耕作土壤，只因生物炭的近期改造不足以使土壤细菌达到原始水平，而人类改造土壤的方式具有相似性，导致生物炭处理与CK的细菌群落结构表现出了相似性。

土壤中不同细菌门类在土壤中发挥着不同的作用，其丰度的变化可能影响土壤的生态功能。因此，在今后的研究中可以进一步研究生物炭对功能微生物多样性、作物抗土传病害及碳、氮代谢途径的影响，为农田土壤微生态的调控和作物的生长发育提供更多理论依据。