褪黑激素保护心肌缺血/再灌注损伤研究进展

徐虎，范利，曹丰

(1解放军总医院第二医学中心心血管内科，北京 100853；解放军总医院：2第二医学中心，4转化医学中心，北京 100853；3解放军总医院国家老年疾病临床医学研究中心，北京 100853)

目前心血管疾病仍然是全球范围内人类主要的死亡原因。早期再灌注是治疗缺血性心脏病最有效的策略，但冠状动脉血管在一定时间重新获得再通时，由于自由基生成增多、钙超载、炎症反应等原因，会出现缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤。褪黑激素主要是由哺乳动物和人的松果体产生，具有调节睡眠、免疫、抗氧化、抗肿瘤等作用，已经被证明可以保护心脏、预防I/R损伤，其机制主要是清除自由基和上调抗氧化系统，以及调控受体介导的信号通路等。本文将从心脏开始缺血到再灌注期间，对褪黑激素诱导心肌保护的相关作用机制及其临床应用和前景进行阐述。

1 褪黑激素受体概述

在哺乳动物中褪黑激素可通过激活至少两个高亲和力的G蛋白偶联受体MT1和MT2发出信号。研究发现Luzindole作为一种褪黑激素受体阻滞剂可以去除褪黑激素的心肌保护作用，由此认为MT1和MT2受体在心肌保护作用中可能具有重要意义[1]。MT3受体是褪黑激素的低亲和力受体，与褪黑激素的结合位点是醌还原酶2(quinone reductase 2,QR2)，该酶在平衡自由基生成中发挥重要作用。目前研究多认为MT3受体可能也参与了褪黑激素对大鼠的心肌保护作用，但具体机制尚待阐明。另外，

维甲酸相关孤核受体(retinoid acid receptor related orphan receptor,ROR)也是褪黑激素的受体。He等[2]发现，在小鼠I/R损伤后，ROR α亚型缺乏会显著增加心肌梗死面积、促进凋亡，加重心功能障碍，同时还能逆转褪黑激素的心肌保护作用。由此可见，ROR在褪黑激素心肌保护中发挥着重要作用。除此之外，肿瘤坏死因子受体2(tumor necrosis factor receptor 2,TNFR2)和toll样受体(toll like receptor,TLR)也参与了褪黑激素的心肌保护作用。笔者考虑褪黑激素是通过激活TNFR2或TLR4(或均激活)以激活下游生存活化因子增强(survivor activating factor enhancement,SAFE)信号通路来介导的心肌保护作用[3,4]。

2 褪黑激素心肌保护作用机制

2.1 相关信号通路

褪黑激素受体激活后，可通过复杂的信号通路引发一系列下游事件，如可抑制蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)，激活PKC和磷脂酶C，使有丝分裂原活化蛋白激酶的激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase1,MEK1) 和MEK 2磷酸化增加，促进细胞外调节蛋白激酶1(extracellular-signal-regulated kinase 1,ERK 1)和ERK2磷酸化增加，从而上调心脏中PKB、信号传导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT-3)和Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)的表达。Genade等[5]发现，褪黑激素还可以显著抵消异丙肾上腺素强大的β-肾上腺素能刺激，发挥抗肾上腺素能效应。具体地，褪黑激素发挥心肌保护作用的通路可概括为以下几种。(1)再灌注损伤救助激酶通路。褪黑激素可通过再灌注损伤救助激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)通路发挥心肌保护作用。Tong等[6]首次证实在心肌保护中需要PKB活化。Amanda等[7]发现褪黑激素治疗引起的心脏梗死面积减小与PKB和ERK激活、促凋亡的丝裂原激活蛋白激酶p38(p38 mitogen-activated protein kinasep 38,MAPK p38)失活有关。除此之外，RISK通路的下游效应物还包括核糖体蛋白S6(p70S6)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和PKC的活化等。(2)SAFE或JAK/STAT通路。SAFE或JAK/STAT通路的下游效应分子包括许多参与细胞存活的蛋白，如脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、细胞周期蛋白D1等。Yang等[8]证实褪黑激素心肌保护作用可被JAK/STAT通路的抑制剂AG490或JAK2 siRNA阻断。(3)沉默信息调控因子通路。沉默信息调控因子(silent information regulator,Sirt)，尤其是Sirt1和Sirt3，在褪黑激素诱导心肌保护作用中发挥重要作用。Sirt1通过对核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、PKB、叉头转录因子(forkhead transcription factor O,FoxO)、p53、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPAR-α)、硫氧还蛋白1(thioredoxin-1,Trx1)等去乙酰化作用调节脂肪酸氧化、心脏肥大、凋亡、氧化应激和自体吞噬[9]。Ding等[10]研究发现褪黑激素的心肌保护作用依赖于Sirt1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC-1α)。同时Han等[11]研究表明褪黑激素促进脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cell,AD-MSCs)对心肌梗死的治疗，可能是通过Sirt1信号通路防止AD-MSCs缺氧/血清剥夺(hypoxia and serum deprivation,H/SD)损伤，以促进AD-MSCs的存活。对于Sirt3，其预防心肌I/R损伤可能是通过线粒体蛋白的去乙酰化调节线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的开放、凋亡和细胞存活实现的。另外，Sirt3还能使FoxO3去乙酰化，导致锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,MnSOD)和过氧化氢酶的转录上调，抑制心肌肥大[12]。但Sirt信号通路与RISK、SAFE通路之间是否存在联系，以及这些信号通路是否相互独立地被激活，还有待进一步阐明。(4)Mst1通路。Mst1是哺乳动物中Hippo通路的主要成分，具有促凋亡作用，可通过磷酸化直接抑制Sirt1的去乙酰化作用。Hu等[13]发现褪黑激素可通过抑制Mst1的磷酸化促进心肌梗死后Sirt1的表达，显著减轻心肌梗死后不良的左室重塑，因此Mst1/Sirt1信号可能是褪黑激素的下游靶点。此外，Mst1在糖尿病心肌病的心肌重塑中也发挥重要作用。Zhang等[14]研究表明，褪黑激素对糖尿病心肌病的有益作用归因于Mst1磷酸化的抑制和Sirt3表达的增加。(5)Notch通路。Yu等[15]发现，褪黑激素的干预增加了Notch1、Hes1和PKB的表达，而Notch1通路激活PKB具有褪黑激素受体依赖性，因此褪黑激素诱导的RISK通路激活可能部分依赖于Notch 1通路。(6)Nrf通路。Nrf2是一种转录因子，与DNA抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合后可调控许多抗氧化反应基因。研究认在为I/R中褪黑激素的有益作用与Nrf2通路的激活密切相关[16]，但Nrf2通路是否与褪黑激素核受体或其他受体以及其他信号通路相关仍有待阐明。

2.2 褪黑激素与线粒体

褪黑激素可通过抑制MPTP的开放发挥心肌保护作用。研究发现，褪黑激素激活的SAFE通路中STAT-3可以抑制MPTP的开放[17]，而STAT-3作用的发挥又依赖于线粒体外膜转运酶20(translocase of the outer membrane,TOM20)[18]。Pei等[19]发现褪黑激素对TOM70缺陷小鼠无心脏保护作用，说明TOM70对褪黑激素心肌保护作用的发挥至关重要。此外，能调节MPTP开放的糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)是RISK、SAFE等多种信号通路的共同靶点，近来也备受关注。

2.3 褪黑激素与抗炎

众所周知，急性心肌缺血诱导的细胞损伤启动了急性促炎症反应，释放了各种促炎症介质。研究表明，TNFR2激活可增加p300/STAT-3/RelA/视神经萎缩相关蛋白1(optical atrophy-1,OPA1)信号转导，增强线粒体融合，促进呼吸活动，上调OPA1的表达，进而保护心肌细胞[20]。鉴于褪黑激素对SAFE通路的影响，我们认为褪黑激素也有可能激活了这一特殊通道。Ma等[21]研究发现，褪黑激素可通过Sirt3/FoxO3a/Parkin信号通路诱导线粒体自噬，抑制动脉粥样硬化病变中炎性小体NOD样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)的长期活化和白细胞介素1β的分泌，显著减弱斑块大小和易感性，从而改善动脉粥样硬化的进展。关于褪黑激素的抗炎作用，有研究已得出可靠的实验室证据，但对于褪黑激素在I/R损伤过程中对心脏自身炎症反应的影响有待进一步明确。

2.4 褪黑激素在心脏微血管中的作用

微血管I/R损伤是由内皮细胞凋亡、肿胀、微血管痉挛和毛细血管阻塞引起。褪黑激素可通过维持内皮屏障功能、保持内皮通透性、减少细胞过度氧化应激和减轻内皮依赖性NO的过度产生来保护微循环。Behram等[22]发现，糖尿病大鼠的心肌肥大与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)的激活有关，糖尿病大鼠冠状动脉血管中VEGF-A的磷酸化与正常大鼠比较显著减少，给予褪黑激素治疗后，磷酸化的VEGF-A显著增加，防止了糖尿病心肌病的发生。Zhou等[23]发现褪黑激素通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)α亚基抑制了线粒体分裂-电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)-己糖激酶亚型2(hexokinase 2,HK2)-MPTP-线粒体自噬通路，从而保护了心脏微血管，并在后续研究中，Zhou等[24]发现褪黑激素通过恢复血小板中PPAR-γ的含量，显著抑制了血小板的活化，进而阻断了线粒体FUN14结构域包含蛋白1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)诱导的线粒体自噬，减弱了I/R损伤。这就表明，PPARγ/FUNDC1/线粒体自噬通路的调控可能是一种减轻I/R损伤的新途径。

2.5 褪黑激素在病理条件下的作用

研究发现，在2型糖尿病大鼠中，Sirt1信号的减少加重了I/R损伤，褪黑激素干预后损伤减轻[25]。同时有研究在1型糖尿病动物中进一步发现褪黑激素减轻I/R损伤的作用与激活AMPK-PGC1α-Sirt3信号通路有关[26]。众所周知，糖尿病妊娠期间的氧化应激会增加后代患产后疾病的风险。Gao等[27]研究表明，与正常大鼠相比，糖尿病妊娠大鼠的后代显示出更大的梗死面积、更严重的心脏功能障碍，具体机制是心脏胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)/PKB信号通路被抑制。但糖尿病妊娠大鼠接受褪黑激素治疗后，IRS-1/PKB信号通路得到恢复，大鼠的后代对I/R损伤的耐受性也显著提高。上述结果提示，母亲糖尿病会使其子女成年后I/R损伤增加，这一现象可通过孕期褪黑激素治疗加以预防，但确切机制仍有待进一步确定。

3 褪黑激素药物应用和临床研究

褪黑激素在实验动物身上取得的积极结果促使研究人员开始评估褪黑激素对人类的影响。有文章报道夜间褪黑激素分泌减少与心肌梗死发生率增加存在潜在联系[28]，冠心病患者褪黑激素水平与健康人群比较显著降低[29]。同时有研究证实褪黑激素不仅能降低健康受试者的血压、血管反应性和循环儿茶酚胺水平[30]，还能降低高血压患者的血压水平[31]。另外，两项RCT试验检测了褪黑激素在大血管手术[32]和冠状动脉搭桥手术[33]中的心脏保护作用。Gogenur等[32]将50例接受腹主动脉瘤手术的患者纳入研究，在手术后第1天、第2天、第3天晚上，给予患者口服10 mg褪黑激素或安慰剂，发现接受褪黑激素治疗的患者与安慰剂组比较心脏病发病率显著降低(4%和29%，P=0.02)。Dwaich等[33]也报告了有利的结果，该研究纳入45例冠状动脉旁路移植术患者，并随机分为安慰剂组、低剂量褪黑激素治疗组(10 mg，口服，1/d)和高剂量褪黑激素治疗组(20 mg，口服，1/d)，结果发现在冠状动脉搭桥手术前5 d给予褪黑激素(10或20 mg)显著改善了患者的射血分数，并以剂量依赖性的方式降低了血浆心肌肌钙蛋白Ⅰ、白细胞介素1β、诱导型一氧化氮合酶和促凋亡蛋白caspase 3的表达。

目前有两项临床试验(NCT00640094和NCT01172171)正在进行，以测试褪黑激素对急性冠心病患者的疗效[34，35]。在MARIA试验(褪黑激素在急性心肌梗死血管成形术中的应用)中，146例急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevated acute myocardial infarction, STEMI)患者在直接经皮冠状动脉介入治疗期间随机接受褪黑激素(静脉和冠状动脉内)或安慰剂治疗，主要终点为梗死灶大小。结果显示，在非限制STEMI人群中，褪黑激素与梗死面积的减少无关[34]。然而，为确定褪黑激素的效果是否受给药时间的影响，研究者对数据进行了事后分析，发现褪黑激素的作用是由再灌注的时机决定，即在症状出现2.5 h以内给予褪黑激素可以减少40%的梗死面积[35]。因此，褪黑激素的给药时间对于心肌保护的实现至关重要。

然而，到目前为止尚无研究确定保护人体心脏所需的最佳褪黑激素剂量。Dominguez-Rodriguez等正计划进行一项新的随机临床试验，旨在确定褪黑激素对心脏死亡和心力衰竭住院治疗的影响。但在得出最终结论之前，需要确定褪黑激素的最佳剂量。此外，最佳的给药方式(口服、静脉给药、冠状动脉内给药或联合给药)仍有待验证。

4 临床应用前景

褪黑激素与其受体之间的相互作用需要进一步评估，而褪黑激素在结合受体后发生的大量信号事件也需要进一步探讨。欧洲心脏病学会主张采用表观遗传学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学相结合的方法来寻找治疗靶点[36]，为寻找褪黑激素诱导心肌保护的最终共同效应物开辟新的可能。总之，只要褪黑激素在剂量、给药方式和给药时机等方面的问题得到解决，其临床应用前景就会值得期待。