王子见 陈融
摘 要:脊髓小脑共济失调Ⅲ型(spinocerebellar ataxia type 3,SCA3)又称马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease,MJD),是由于编码谷氨酰胺的密码子CAG的异常扩增而引起的1种常染色体显性遗传疾病。索拉菲尼是1种新型多靶向性的治疗肿瘤FDA药物,通过构建SCA3细胞模型,利用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)等技术手段,探索索拉菲尼对SCA3细胞模型中突变蛋白ataxin-3引起的细胞凋亡的影响。结果表明,不同浓度的索拉菲尼药物处理2h后,对SCA3细胞凋亡没有抑制作用,也没有毒性作用,但在浓度为1μM时,有抑制细胞凋亡的趋势;在加药24h后,对细胞凋亡没有抑制作用,而且在浓度为100μM和1000μM时,对SCA3细胞模型具有毒性作用。此研究丰富了旧药新作用,为后续实验也提供了作用浓度和时间的参考依据。
关键词:脊髓小脑共济失调Ⅲ型;索拉菲尼;MTT法
中图分类号 R735.7 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2018)18-0015-03
The Effect of Sorafenib Tosylate on Apoptosis Induced by Pathogenic Protein Ataxin-3 in SCA3 Cell Model
Wang Zijian et al.
(College of Biological and Environmental Engineering,Xi'an University,Xi'an 710065,China)
Abstract:Spinal cerebellar ataxia type 3(SCA3),also known as Machado-Joseph disease(MJD),is an autosomal dominant genetic disease caused by abnormal amplification of codon CAG encoding glutamine. Sorafenib tosylate is an FDA drug to treat cancer by the various pathways. Based on the various targets of Sorafenib tosylate,this study proposes that whether it has an effect on SCA3 cells. The effect of sorafenib tosylate on apoptosis induced by pathogenic protein ataxin-3 in SCA3 cell model was explored via MTT method and other methods. The results show thart. In this study,sorafenib tosylate did not inhibit the apoptosis induced by pathogenic protein ataxin-3 and no toxic effect for 2 hours However,it showed the inhibited tendency at the concentration of 1μM after the treatment of 2 hours. It was also found that sorafenib tosylate showed toxic to cells at the concentration of 100μM and 1000μM after the treatment of 24 hours. This investigation offers new function of old drug and also provides a proof of concentration and treatment time of sorafenib tosylate for further studies.
Key words:Spinocerebellar ataxia type 3;Sorafenib tosylate;MTT method
随着人口老龄化的加剧,神经退行性疾病的发病率逐年递增。遗传性脊髓小脑共济失调是常见的中枢神经变性疾病,该病有诸多亚型,其中脊髓小脑性共济失调Ⅲ型(SCA3)是最常见的1种亚型,其致病机制是SCA3中CAG的异常扩增序列导致编码蛋白ataxin-3的羧基端出现,形成较长的多聚谷氨酰胺肽链[1]。该多聚谷氨酰胺肽链被认为是细胞形成包涵体的蛋白质基础,从而产生细胞凋亡,但CAG重复长度与脊髓小脑共济失调型小脑变性的发生率无关[2]。该病的临床表现复杂多變,有小脑共济性失调,眼珠运动障碍等症状,因此基因学检测是诊断该病的最佳手段。目前针对SCA3,临床上大多为对症治疗或延缓病情,如采用脐带间充质干细胞治疗,在一定程度上能够改善脊髓小脑性共济失调患者的临床症状,且较为安全[3]。也有学者提出针对人ATXN3的反义寡核苷酸可能具有良好的耐受性,进行SCA3的预防性治疗[4]。有研究发现,丙戊酸钠对SCA3细胞模型具有神经保护作用[5]。而丙戊酸钠的不良反应主要集中在10岁以下的儿童[6],因此该药针对儿童使用还需进一步探讨。针对神经退行性疾病较多的病因,张文婷提出针对神经退行性疾病的多靶点药物,设计出的PARP-1抑制剂(1-7)[7]具备多功能神经保护作用。
索拉菲尼是1种具有较好抗肿瘤作用的新型靶向药物,是首个获准上市的多靶点酪氨酸激酶抑制剂,该药的优点包括具备多靶点机制,耐受性好,易于联合用药,且患者的依从性也更好。神经退行性疾病比如马查多—约瑟夫病(Machado-Joseph disease,MJD)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)以及帕金森病(Parkinson's disease,PD)等均是由多种病因引起,造成神经细胞死亡的过程也十分复杂。而只是以单个靶点为基础而设计的药物在治疗这类疾病上并没有达到令人满意的效果。现在,对于中枢神经系统紊乱疾病,随着其致病因素和发病机制不断被发现,具备多靶点治疗作用的药物也纳入研究中,这为治疗神经退行性疾病提供了新思路,也为其药物研究开辟了1个崭新的领域。目前,对于多靶点功能的索拉菲尼,还没有在神经退行性疾病上治疗的相关研究。本研究主要讨论不同时间及浓度的索拉菲尼对SCA3细胞模型的作用,以此为神经退行性疾病的研究提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料 HEK293细胞由伦敦大学学院薛少安教授惠赠。peGFP-ataxin-3-77CAG质粒由德国图宾根大学Thorsten Schimdt博士惠赠。索拉菲尼购自Santa Cruz Biotechnology公司(Cat.No.475207-59-1)。
1.2 方法
1.2.1 质粒转化和提取 取出感受态细胞DH5α(大肠杆菌)于冰上融化,加入质粒,混匀,置于冰上30min;随后42℃热击90s,迅速置冰上,加入不含抗生素的LB培养基混匀,37℃恒温摇床(150rpm)摇45min。取出菌液,划线涂板,37℃倒置过夜培养;选取菌落进行挑菌,PCR鉴定。将PCR鉴定成功的菌落挑出,加入培养基,37℃摇床(150rpm)摇菌过夜。次日,取出菌液,离心(2000rpm,10min),棄去上清液,按照GIAGEN plasmid mini kit试剂盒说明书提取质粒,使用Nanodrop2000检测质粒浓度。
1.2.2 转染与加药 按照梭华sofast转染试剂说明书,取2μg质粒,3μL梭华sofast,100μL培养液,室温静置30min,加入到六孔板内。24h后,转移至96孔板,24h后加药处理,DMSO为阴性对照组,只含细胞为未处理对照组,药物时间分别为2h和24h。如图1所示,浓度依次为“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”,“D”为DMSO阴性对照、“空”为未处理对照组。
1.2.3 MTT法检测 取出96孔板,每孔加入10μL MTT,放入37℃,5%CO2的培养箱中,4h后取出,离心,小心吸去上层清液,再加入100μL的DMSO,放入恒温培养震荡器中孵育10min,保证甲臜能充分溶解,而后将96孔板放入在酶联免疫检测仪中,测定于490nm波长时各孔的紫外光吸收值(OD值),分析数据。
2 结果与分析
2.1 SCA3细胞模型的构建 将peGFP-ataxin-3-77CAG质粒转染至HEK293细胞,48h后,突变ataxin-3蛋白过度表达,收集裂解细胞,Western blot检测目的条带。结果显示,ataxin-3蛋白过表达,SCA3细胞模型构建成功。1H9抗体检测ataxin-3蛋白,大小为75kD的目的蛋白条带,β-actin抗体检测为42kD的actin内参蛋白条带。条带1,2和3为3个蛋白样品。
2.2 索拉菲尼对SCA3细胞模型处理2h的影响 SCA3细胞模型构建成功后,将细胞进行药物处理,2h后,加入MTT,后加入DMSO溶解细胞形成中的甲臜,用酶联免疫检测仪在490nm波长处检测吸光值(OD值)。统计学分析显示,索拉菲尼在对SCA3细胞模型处理2h后,不同浓度的药物处理组和DMSO阴性对照组相比均没有统计学差异。这表明索拉菲尼对SCA3细胞模型中对突变ataxin-3引起的细胞凋亡没有作用,同时,该药物在不同浓度范围内均对SCA3细胞模型没有毒性。此外,在药物浓度为1μM时,与DMSO对照组相比,虽然没有显著性,但OD值相对值有增高的趋势,这表明在该浓度时,药物可能有抑制细胞凋亡的作用。
以不同浓度药物处理组和DMSO阴性对照组,分别与空白组的光吸收值的比值为纵坐标,以不同处理组为横坐标,取3次独立实验的平均值,每次独立实验重复孔为5个,统计学分析方法为独立样本T检验。
2.3 索拉菲尼对SCA3细胞模型处理24h的影响 以上实验表明,2h的作用时间效果可能不明显,因此下一步将SCA3细胞模型进行药物处理24h,加入MTT,后加入DMSO溶解细胞形成中的甲臜,用酶联免疫检测仪在490nm波长处检测吸光值。结果显示,索拉菲尼在对SCA3细胞模型处理24h后,进行统计学分析,对突变ataxin-3引起的细胞凋亡没有作用,但是,在药物浓度为100μM和1000μM时,与DMSO对照组相比,具有显著差异,这表明这2个药物浓度对SCA3细胞模型有毒性作用。
以相对OD值(不同浓度药物处理组和DMSO阴性对照组,分别与空白组的光吸收值的比值)为纵坐标,以不同的处理组为横坐标,取3次独立实验的平均值,每次实验重复孔为5个,进行独立样本T检验分析。**P<0.01。
3 结论与讨论
研究结果表明,索拉菲尼处理2h后的结果进行统计学分析并没有显著差异,说明此药对突变ataxin-3引起的细胞凋亡没有作用,对SCA3细胞模型也没有毒性作用,但从图3可以看出在药物浓度为1μM时,有抑制突变ataxin-3引起的细胞凋亡的趋势,可作为后来研究者的参考浓度。而在索拉菲尼处理24h后,浓度为100μM和1000μM时,独立样本T检验分析,和DMSO对照组比对,具有显著差异,这说明在24h的药物处理中,这2个药物浓度对SCA3细胞模型具有显著毒性作用。因此,在后续的相关实验中,应当尽量避免使用这2个浓度。而在其它浓度中均无显著差异,说明索拉菲尼对SCA3细胞模型没有毒性作用,因此可以作为后续实验的参考浓度。综上所述,在本实验中,2h时的药物处理后,在单一浓度1μM时,索拉菲尼有抑制突变ataxin-3引起的细胞凋亡的趋势;而在加药处理24h,索拉菲尼毒性加大,不仅没有抑制细胞凋亡的作用,在浓度为100μM和1000μM,产生细胞毒性作用。本实验中得到的数据可供后续实验参考,以及今后研究中,可进一步优化药物作用时间,在2h和24h之间取不同时间继续探讨索拉菲尼的作用效果。
脊髓小脑共济失调Ⅲ型(SCA3)是1种遗传性的神经退行性疾病,该病致病机制复杂,主要是因为编码谷氨酰胺的密码子CAG的数量在ATXN3基因中的异常扩增,形成突变的ataxin-3蛋白并汇聚形成包涵体,进而会对细胞产生毒害作用。这个过程已知发生在患者易感脑区的神经元胞核内,但是该过程中的包涵体聚集和致病机制至今不明,也没有有效的治疗药物,给患者和患者家属造成了严重的身体、经济和社会负担。索拉菲尼是1种新型多靶点抗肿瘤药物,具有双重的抗肿瘤作用:一方面通过抑制由RAF/MEK/ERK介导的细胞信号传导通路而直接抑制肿瘤细胞的增殖,另一方面通过抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR)和血小板衍生生长因子(PDGF)受体而阻断肿瘤血管的形成,间接地抑制肿瘤细胞的增殖和转移[8]。为了寻找有效药物来预防及治疗该疾病,根据索拉菲尼多功能靶点功效,本研究通过构建脊髓小脑共济失调Ⅲ型(SCA3)细胞模型,以发病的病理现象(致病蛋白ataxin-3引起的细胞凋亡)作为出发点,利用MTT,Western blot等技术手段,探索索拉菲尼对SCA3细胞模型中致病蛋白ataxin-3引起的细胞凋亡的影响,验证索拉菲尼是否对SCA3细胞模型具有保护作用,从而为该病的治疗提供1种新的思路。
参考文献
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[8]张惠洁,郭卫东.索拉菲尼在肿瘤治疗中的研究进展[J].2013,7(1):258-260.
(责编:王慧晴)