Nf-κb在遗传性糖尿病长爪沙鼠多种组织中的表达状况*

龚菁菁 李小红 王存龙 李银银 陈振文 杜小燕

(首都医科大学基础医学院，北京 100069)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是严重威胁人类健康的重大疾病之一。在我国，随着生活方式的改变及人口老龄化，DM的患病率不断上升，成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大严重危害人类健康的慢性终身疾病。我国成人糖尿病患病率平均为11.6%，患病人数已达到1.14亿[1]。2型糖尿病是糖尿病的主要类型，约占糖尿病人的90%[2]。2型糖尿病是由遗传因素和环境因素共同作用导致的复杂遗传病，以葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗为主要特征[3]。但2型糖尿病的发病机制仍不完全清楚，由于糖尿病是多基因控制的复杂疾病，易感基因的存在及其功能改变是影响糖尿病发生的重要因素。本课题组前期利用自行培育的近交系长爪沙鼠2型糖尿病模型材料，通过抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)的方法在高血糖和正常血糖长爪沙鼠骨骼肌中发现核转录因子κb(Nuclear factor κB，Nf-κb)差异表达。但其在自发性2型糖尿病长爪沙鼠不同组织中的表达水平如何还不得而知。因此，本文主要研究Nf-κb在糖尿病沙鼠和正常沙鼠的骨骼肌、肝脏、肾脏、脂肪、心脏和脑组织中mRNA和蛋白水平的表达情况，以期寻找长爪沙鼠糖尿病模型致病机制中Nf-κb的作用和靶器官，为研究长爪沙鼠2型糖尿病新模型的发生机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取近交系糖尿病模型长爪沙鼠和正常对照组沙鼠各6只，12～15周龄，雌雄各半。所有长爪沙鼠均来自首都医科大学实验动物部，饲养于控制温湿度的普通环境中(SYXK(京)2013-0005)。

1.2 样品采集

动物过量麻醉安乐死后，解剖采集新鲜组织后立即置于液氮中。样品包括患糖尿病和正常长爪沙鼠的骨骼肌、肝脏、腹部脂肪、肾脏、心脏、脑组织。

1.3 RNA提取及cDNA的制备

从液氮中取出冻存的长爪沙鼠6种组织，分别加入约1 mL TRIzol Reagent(Invitrogen，USA)，用均质器将组织打碎，于室温放置1 min，然后加入约200 μL的三氯甲烷，混匀后4 ℃放置15 min，4℃14 000 r/min 离心15 min，转移上层水相至新离心管，加入约500 μL异丙醇，混匀后4 ℃静置10 min，4℃ 14 000 r /min 离心15 min，弃上清。加入70%乙醇颠倒洗涤沉淀，4℃ 12 000 r/min 离心10 min，弃上清。重复以上步骤1次，以充分洗去沉淀所含盐分。室温自然干燥，加入适量的RNA-Free水溶解得到总RNA。脂肪组织的总RNA提取用脂肪RNA提取试剂盒进行(Qiagen, USA)。采用Nanodrop 2000c(Thermo scientific, USA)分析RNA浓度和纯度。按照快速反转录试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)对上述总RNA样品进行逆转录，得到相应的cDNA。

1.4 Q-PCR

按照SSH得到的Nf-κb基因片段序列，利用 Primer Premier 5.0 设计PCR扩增引物多对。除肌肉选取Gapdh基因作为内参外，其他组织均选取β-actin基因作为内参基因并设计引物。引物序列如表1所示，均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

表1 Nf-κb和内参基因Q-PCR引物序列

采用Real-time PCR法在Bio-Rad CFX96 manager System上对Nf-κb的mRNA水平进行检测。所用试剂为实时定量PCR试剂盒(天根)，反应体系为20μL。反应条件如下: Q-PCR Master Mix 10μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 7.8μL。反应程序均为: 95℃ 15min，之后95℃ 10s，58℃ 35s，共扩增40个循环，每个循环结束时检测荧光; 熔解曲线分析从60℃到95℃，每0.5 ℃检测一次。

1.5 Western blotting

取液氮冻存的长爪沙鼠骨骼肌、肝脏、肾脏、脂肪、心脏和脑组织，剪碎后用组织蛋白提取试剂盒(康为世纪)提取总蛋白，用BCA定量法对蛋白进行定量。取30μg总蛋白进行SDS-AGE凝胶电泳分离，电转蛋白至NC膜。以TBS(25 mmol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, pH7.2)含5%脱脂牛奶和0.05% Tween-20 封闭过夜。用Nf-κb抗体(1∶1 000稀释，CST，USA)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后与二抗(辣根过氧化酶联的抗兔血清)室温孵育1 h，TBST洗膜后用化学发光法显色。骨骼肌、肝脏、肾脏、心脏和脑组织选用Gapdh做内参基因，脂肪组织选用β-actin作为内参基因。最后用凝胶图像分析系统(Bio-Rad)扫描蛋白质印迹条带灰度。

1.6 统计方法

所有数据均采用SPSS 16.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验方法分析。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Nf-κb基因在糖尿病沙鼠和对照组的6种组织中mRNA表达的差异

采用实时定量荧光PCR法分别检测了糖尿病沙鼠和正常沙鼠的骨骼肌、肝脏、脂肪、肾脏、心脏和脑组织Nf-κb的mRNA表达水平。结果发现，与对照组相比，在骨骼肌中Nf-κb在糖尿病组有高表达趋势(图1)。参考SSH的结果，该基因在糖尿病沙鼠中的表达量高于正常沙鼠，所以该结果与SSH结果相吻合。在脂肪、肝脏和心脏组织中，Nf-κb在糖尿病组的表达量均低于对照组，而脂肪组织mRNA表达量的降低有显著性差异。在肾脏和脑组织中，Nf-κb在糖尿病组有高表达的趋势。

图1 Nf-κb在糖尿病和对照组长爪沙鼠6种组织中的mRNA表达水平

2.2 NF-κB在糖尿病沙鼠6种组织中蛋白的表达水平

Western Blotting检测NF-κB蛋白在6种组织中的表达结果显示，骨骼肌中糖尿病组的蛋白水平高于对照组，与Real-timePCR的趋势一致(图2)。脂肪和心脏组织中NF-κB在糖尿病组中蛋白水平略低于对照组，与其mRNA的表达趋势相一致。而肝脏、肾脏和脑组织中，糖尿病组与对照组相比NF-κB蛋白是略微增加的，肾脏和脑组织的NF-κB在mRNA和蛋白水平表达趋势相吻合。

图2 NF-κB在糖尿病沙鼠6种组织中蛋白的表达情况

3 讨论

在糖尿病人群中，2型糖尿病人占比最高[4]，因此，对其机制的研究一直是糖尿病研究的热点。2型糖尿病作为多基因控制的复杂疾病，寻找和确定易感基因尤为重要，目前对T2DM的病因和关键基因的筛选还远远不够，通过糖尿病动物模型筛选易感基因已成为研究2型糖尿病发病机制的重要的手段。近年来，越来越多自发性糖尿病动物模型的出现能模拟各种人类糖尿病的症状，成为研究糖尿病遗传相关分子机制的关键载体[5]。本课题组前期经过定向培育逐步形成了一个长爪沙鼠自发性糖尿病模型群体，其生化指标和病理组织形态均符合糖尿病标准，且这些性状具有遗传性，是研究2型糖尿病的病生理特点以及致病机制理想的动物模型和实验材料。为了更深入探索该模型发生的分子机制，我们又通过SSH方法从骨骼肌中筛选出糖尿病和正常沙鼠差异表达的基因并进行序列比对和分类。本研究挑选出了其中可能与糖尿病和代谢相关的候选基因核转录因子κb(Nuclear factorκB，Nf-κb)进行了不同组织器官的表达水平分析。

由于2型糖尿病是一类重要的代谢性疾病，外周组织和核心器官的代谢和功能都可能受到影响，本研究选取了骨骼肌、肝脏、脂肪、肾脏、心脏和脑组织进行分析，因为这些组织器官均是重要的糖代谢器官或糖尿病受累器官。Nf-κb是一个重要的炎症因子，而炎症状态与胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病等代谢综合征的发展相关[6]。早在1986年，Sen和Baltimore[7]首次发现，在B细胞核提取物中有一种能与免疫球蛋白κ的轻链编码基因增强子κB序列(GGGACTITCC)特异结合的核蛋白因子，称之为Nf-κb。实际上，各种致癌物质、生长因子、微生物群和促氧化剂造成的炎症刺激都可以激活Nf-κb，其在炎症中起着核心作用，同时也在很多癌症中表达[8]。Nf-κb通过调节靶基因表达，从而参与炎症、免疫反应、细胞凋亡和肿瘤等相关的病理过程，且在2型糖尿病致病机制中发挥着重要的作用。本试验对高血糖长爪沙鼠和正常长爪沙鼠几种重要组织器官中Nf-κb的表达水平的研究结果表明，虽然在肝脏等器官中其表达水平有变化趋势，但没有统计学差异。只有在脂肪组织中的表达是降低的，据文献报道，肥胖能激活Nf-κb从而增加2型糖尿病的风险[8-9]，肥胖症或肝脏脂肪变性的小鼠体内低水平的IKK-β会增加Nf-κb的活性，从而促进2型糖尿病的发展[10]。食源性肥胖小鼠的肝细胞中Nf-κb是高表达的，而抑制Nf-κb可以改善肝脏胰岛素敏感性，并且抑制了cAMP/PKA通路。我们的实验结果显示，在糖尿病长爪沙鼠中，无论是肝脏还是脂肪中的Nf-κb都是低水平表达的，这可能是和我们挑选的动物不是肥胖型糖尿病有关，也间接说明肥胖对Nf-κb的刺激在肥胖引起的糖尿病高风险中发挥更重要的作用。

总之，在长爪沙鼠糖尿病模型中，我们发现Nf-κb在脂肪中的表达水平降低，可能与糖尿病的发生发展有关，这为研究长爪沙鼠2型糖尿病的发生机制提供了一个新的思路。