肝胃百合汤对慢性应激与幽门螺杆菌双重损伤因素模型小鼠胃黏膜组织TFF1、p-ERK蛋白表达的影响

喻斌 曾孟晖 徐寅 阳力 周赛男 杜珊 毛一之 李珍 李玲

摘要：目的  觀察肝胃百合汤对慢性应激与幽门螺杆菌（Hp）双重损伤因素模型小鼠胃黏膜组织三叶因子1（TFF1）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）蛋白表达的影响，探讨其治疗慢性应激性胃溃疡合并Hp感染的相关机制。方法  将60只BALB/c雄性小鼠随机分为空白组、应激组、单纯Hp组、双重因素组、肝胃百合汤组、雷尼替丁组，每组10只，选取10种不可预知刺激因素制备慢性应激小鼠模型，造模第7日给予单纯Hp组、双重因素组、肝胃百合汤组、雷尼替丁组灌胃Hp菌液;肝胃百合汤组给予肝胃百合汤灌胃，雷尼替丁组给予雷尼替丁灌胃，其余各组给予蒸馏水灌胃。采用免疫组化检测小鼠胃黏膜组织TFF1、p-ERK蛋白表达。结果  双重因素组溃疡指数与TFF1、p-ERK蛋白表达明显高于空白组（P<0.01）;与双重因素组比较，肝胃百合汤组和雷尼替丁组溃疡指数显著降低（P<0.01），且肝胃百合汤组明显低于雷尼替丁组（P<0.01）;肝胃百合汤组和雷尼替丁组TFF1、p-ERK蛋白表达明显高于双重因素组（P<0.05，P<0.01），且肝胃百合汤组明显高于雷尼替丁组（P<0.01）。结论  慢性应激与Hp可协同致胃黏膜损伤，肝胃百合汤可促进TFF1、p-ERK的表达及胃黏膜的修复，达到促进溃疡愈合的目的。

关键词：肝胃百合汤;慢性应激性胃溃疡;幽门螺杆菌;三叶因子1;磷酸化细胞外信号调节激酶;小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.011

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2018）10-0044-05

Effects of Ganwei Baihe Decoction on Protein Expressions of TFF1 and p-ERK in Gastric Mucosa of Model Mice with Chronic Stress and Helicobacter Pylori Double Injury Factors

YU Bin¹， ZENG Meng-hui²， XU Yin¹， YANG Li¹， ZHOU Sai-nan¹， DU Shan²， MAO Yi-zhi²， LI Zhen¹， LI Ling¹

1. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To observe the effects of Ganwei Baihe Decoction on the protein expressions of TFF1 and p-ERK in gastric mucosa of model mice with chronic stress and Helicobacter pylori （Hp） double injury factors; To explore the relevant mechanism for treating chronic stress gastric ulcer complicated with Hp infection. Methods Totally sixty BALB/c male mice were randomly divided into blank group， stress group， Hp group， double factors group， Ganwei Baihe Decoction group， and ranitidine group， with 10 mice in each group. 10 unpredictable stimulus factors were selected to prepare chronic stress mouse models. On the 7^th day of modeling， Hp group， double factors group， Ganwei Baihe Decoction group， and ranitidine group were given Hp bacteria， Ganwei Baihe Decoction and ranitidine were given to corresponding groups for gavage， respectively， and the other groups were given distilled water for gavage. The protein expressions of TFF1 and p-ERK in gastric mucosa of mice were detected by immunohistochemistry. Results The ulcer index and protein expressions of TFF1 and p-ERK in the double factors group were higher than those of the blank group （P<0.05， P<0.01）; Compared with double factors group， the gastric mucosal injury index decreased in Ganwei Baihe Decoction group and ranitidine group （P<0.01）， and Ganwei Baihe Decoction group was lower than ranitidine group （P<0.01）; The protein expressions of TFF1 and p-ERK in Ganwei Baihe Decoction group and ranitidine group were significantly higher than those in double factors group （P<0.01），and Ganwei Baihe Decoction group was higher than ranitidine group （P<0.01）. Conclusion Chronic stress and Hp can cause gastric mucosal injury in synergy; Ganwei Baihe Decoction can promote the repair of gastric mucosa and expressions of TFF1 and p-ERK， so as to enhance ulcer healing.

Keywords： Ganwei Baihe Decoction; chronic stress gastric ulcer; Helicobacter pylori; TFF1; p-ERK; mice

胃溃疡是指胃黏膜在某种情况下被胃酸/胃蛋白酶自身消化而造成的溃疡，其深度达到或超过黏膜肌层。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是消化性溃疡的一个主要风险因素。Matsushima Y等^[1]调查发现，日本神户大地震后由于精神压力过大引起的胃溃疡患者明显增多，而Hp对于该病的发生有着重要的影响。Yamamoto N等^[2]根据调查结果，选用小鼠对应激与Hp协同致胃黏膜损伤的作用进行研究，证实Hp会加剧由强迫小鼠游泳而引起的胃组织损伤。还有研究表明，慢性心理应激可增加BALB/c小鼠胃内Hp的定植量，加重Hp感染后的胃黏膜损伤^[3]，证实慢性应激与Hp两者可协同致胃黏膜损伤。

現代医学对于慢性应激合并Hp感染导致的消化性溃疡通常采用三联或四联疗法根除Hp，虽见效快，但存在耐药性高、不良反应多、成本较高等缺点。肝胃百合汤是湖南省夏度衡教授创制，也是湖南中医药大学第一附属医院治疗肝胃气滞型胃溃疡合并Hp感染常用验方。我们前期研究发现，肝胃百合汤可改善肝胃气滞型胃溃疡患者的不适症状，修复胃黏膜损伤，并能有效根除Hp^[4-7]。本实验在前期研究的基础上，观察肝胃百合汤对慢性应激与Hp双重损伤因素模型小鼠胃黏膜组织三叶因子1（trefoil factor 1，TFF1）、磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylating extracellular signal-regulated kinases，p-ERK）蛋白表达的影响，探讨其治疗慢性应激性胃溃疡合并Hp感染的相关机制。

1  材料与方法

1.1  动物及菌种

雄性健康BALB/c小鼠60只，SPF级，6周龄，体质量19～22 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SYXK（湘）2015-0003。饲养于温度20～25 ℃、相对湿度50%～70%环境。幽门螺杆菌：悉尼标准菌株（Sydney strain I，SSI），其中含有空泡细胞毒素（vacA）和细胞毒素相关基因（cagA）蛋白，浓度为1×l0⁹ cfu/mL，湖南中医药大学微生物免疫教研室提供。

1.2  药物

肝胃百合汤（百合15 g，柴胡9 g，郁金9 g，乌药9 g，川楝子9 g，丹参9 g，白芍9 g，蒲公英15 g，甘草6 g），饮片均购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，将饮片放入凉蒸馏水中，浸泡30 min后煎煮2次，将药汁混合后过滤，浓缩至每1 mL含原药材1 g，离心，去掉残渣，4 ℃冰箱冷藏备用。盐酸雷尼替丁胶囊，佛山手心制药有限公司，批号1602224。

1.3  主要试剂与仪器

PBS（Wellbio公司），枸橼酸盐缓冲液（Wellbio公司），二步法试剂盒（中杉金桥公司），DAB试剂盒（中杉金桥公司），胶体金法幽门螺杆菌检测试剂盒（艾康生物技术有限公司），p-ERK一抗（Abcam公司），TFF1一抗（Proteintech公司）。奥林巴斯摄像显微镜（PM 8AD），数码凝胶图像处理系统（GIS-1000），Image-Pro-Plus图像分析软件（Media Cybernetics）。

1.4  分组和造模

将60只BALB/c雄性小鼠按体质量分层随机分为空白组、应激组、单纯Hp组、双重因素组、雷尼替丁组和肝胃百合汤组，每组10只。参照文献[8-9]方法，选取10种不可预知刺激因素制备慢性应激小鼠模型，每日上午9时更换刺激方法，连续28 d。空白组及单纯Hp常规饲养，自由摄食。造模第7日给予单纯Hp组、双重因素组、肝胃百合汤组、雷尼替丁组灌胃Hp菌液0.5 mL/只（1×10⁹ cfu/mL），灌胃前24 h禁食、4 h禁水，灌胃后禁食禁水2 h。隔日1次，连续3次。28 d造模结束后，将小鼠断尾取血，使用胶体金法检测血清Hp抗体，取胃黏膜制作病理切片，电镜观察炎症情况。

1.5  给药

造模14 d后肝胃百合汤组小鼠给予肝胃百合汤灌胃，给药前按人体用药量换算成小鼠等效剂量，小鼠用药量为12.2 g/（kg·d）。雷尼替丁组给予盐酸雷尼替丁（参考60 kg成人每日用量），给药前用蒸馏水溶解，按人体用药量换算成小鼠等效剂量，小鼠用药量为40 mg/（kg·d）。其余组分别灌服等体积蒸馏水，给药体积均为0.4 mL/d。每日造模前1 h每组分别给予相应药物或蒸馏水灌胃，连续14 d。给药2周后，全部小鼠禁食禁水12 h后处死，取出胃标本，沿大弯侧剪开胃黏膜，用冰生理盐水将胃内残留物冲洗干净。在胃黏膜损伤较明显处取1 cm×0.5 cm黏膜组织，生理盐水冲洗干净，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，切片（厚度5 ?m），用于免疫组化检测。

1.6  溃疡指数及溃疡抑制率测定

根据Guth标准^[10]计算溃疡指数（UI）及溃疡抑制率。使用微测尺按黏膜溃疡或糜烂长度：斑点状糜烂计1分，糜烂长度<1 mm计2分，1 mm<糜烂长度≤2 mm计3分，2 mm<糜烂长度≤3 mm计4分，糜烂长度>3 mm计5分;糜烂宽度>1 mm时则分值加倍，全胃得分之和为UI。溃疡抑制率（%）=（模型组溃疡平均指数-给药组溃疡平均指数）÷模型组溃疡平均指数×100%。

1.7  HE染色

石蜡包埋，切片，脱蜡，水洗，置于苏木素染液中浸染2～4 min，水洗;使用1%盐酸分化约10 s，水洗;流水冲洗5～l0 min，当细胞核由淡紫红色变为蓝色后，伊红染液中浸染30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.8  胃黏膜组织三叶因子1、磷酸化细胞外信号调节激酶蛋白表达检测

采用免疫组化法。石蜡切片脱蜡至水，二甲苯中浸泡2次，每次10 min，梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）放置5 min，蒸馏水浸洗5 min;枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）微波炉加热修复抗原，冷却后PBS冲洗3次×3 min;3%H₂O₂浸泡10 min灭活内源性酶。PBS冲洗3次×3 min，分别滴加p-ERK、TFF1一抗。4 ℃过夜。PBS冲洗3次×5 min;滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次×5 min;滴加DAB显色剂显色，室温孵育1～5 min，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤;苏木素复染5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。使用Image-Pro-Plus圖像分析软件对样本图像进行分析。每个样本随机选取3个高倍视野，计算黄褐色阳性表达的面密度（阳性表达总面积÷统计区域总面积），以此表示p-ERK、TFF1蛋白的表达，进行半定量分析。

1.9  统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以x（—）±s表示，多组间比较用方差分析，符合正态分布且方差齐用LSD法，方差不齐用Tamhane's T2法，不符合正态分布用非参数检验;计数资料用率或构成比表示，采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  肝胃百合汤对模型小鼠溃疡指数及溃疡抑制率的影响

与空白组比较，单纯Hp组、应激组和双重因素组UI显著增加，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与双重因素组比较，肝胃百合汤组和雷尼替丁组UI显著降低（P<0.01），且肝胃百合汤组明显低于雷尼替丁组，差异有统计学意义（P<0.01）;肝胃百合汤组溃疡抑制率高于雷尼替丁组。结果见表1。

2.2  HE染色结果

空白组胃黏膜表面光整平滑，无明显充血、水肿，上皮细胞及腺体排布整齐;单纯Hp组胃黏膜充血肿胀，表面欠光滑平整，可见少量糜烂，腺体排布较杂乱，有炎性细胞浸润;应激组胃黏膜上皮破损，皱襞中断，可见细胞脱落、组织溶解，可见少量糜烂及点状溃疡，有较多炎性细胞浸润;双重因素组胃黏膜上皮明显破损，出现连续性中断，可见明显细胞脱落、组织溶解、出血倾向，有较多糜烂、点状溃疡，可见较多炎性细胞浸润，浸润甚至可至黏膜底层;肝胃百合汤组胃黏膜损伤较双重因素组明显减轻，腺体排列规整，少数有轻度充血水肿，有少量点状糜烂，未见明显溃疡，有少量炎性细胞浸润;雷尼替丁组胃组织表面尚光整，有轻度水肿，腺体排布较规整，受损黏膜较表浅，可见少量糜烂，无明显溃疡，可见炎性细胞浸润。见图1。

2.3  免疫组化染色结果

免疫组化结果显示，黄褐色区域为阳性表达。光镜下观察，空白组小鼠胃黏膜组织TFF1、p-ERK有少量表达;单纯Hp组、应激组和双重因素组小鼠胃黏膜组织TFF1、p-ERK表达均明显多于空白组，且双重因素组多于单纯Hp组、应激组;肝胃百合汤组和雷尼替丁组TFF1、p-ERK蛋白有大量的阳性表达，明显多于双重因素组，且肝胃百合汤组多于雷尼替丁组。结果见图2～图5。

2.4  肝胃百合汤对模型小鼠胃黏膜组织三叶因子1、磷酸化细胞外信号调节激酶蛋白表达的影响

与空白组比较，单纯Hp组、应激组和双重因素组TFF1、p-ERK蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与双重因素组比较，肝胃百合汤组和雷尼替丁组TFF1、p-ERK蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），且肝胃百合汤组TFF1蛋白表达优于雷尼替丁组，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表2。

3  讨论

慢性应激性胃溃疡属中医学“胃脘痛”“胃疡”等范畴，其发病多是因先天禀赋不足、情志不畅、饮食起居不节等导致脾胃气机不畅，升降失司而引起。其标在胃，其本在肝脾。基本病机为胃气失和，气机不利。感染Hp后病证常表现为湿热，Hp可传染、易反复的特征也与中医理论中湿热邪气致病的表现相似。因此，治疗应以疏肝和胃、行气止痛、清热除湿为主。肝胃百合汤是夏度衡教授的经验方，夏老根据历代医家著述及多年行医经验，提出“后天脾胃难离肝”的观点，在遣方用药时重视肝胃之间的关系。肝乃刚脏，内寓相火，治肝时忌用一派辛散之品，因刚燥之品使肝木愈肆、耗散脾胃气阴，肝胃百合汤充分体现了夏老的这一学术主张。

研究发现，Hp与应激对于胃黏膜的破坏有着协同作用，Hp会导致由应激引起的消化性溃疡的进一步发展^[11]。TFF1是一类结构独特的小分子多肽，有抗腐蚀、耐酸、耐热及抗酶分解的功能，对胃黏膜保护及损伤后修复起着重要作用，尤其对促进黏膜愈合有特别作用^[12]。Ulaganathan M等^[13]研究发现，胃黏膜受损后4～28 d，TFF1及其mRNA在胃黏膜上皮细胞中的表达显著增加，表明TFF1有保持胃黏膜完整、加快溃疡恢复、加强消化道黏膜自身防护能力的作用。p-ERK是ERK的活性形式，可使转录因子活化，促进DNA表达，影响细胞代谢及功能同步等，对于调节细胞新陈代谢和基因表达有其独特的作用。满晓华等^[14]研究发现，p-ERK1/2在正常大鼠胃黏膜中表达极微弱，但在接受应激刺激后，其表达显著升高。刘密等^[15]制作应激性胃黏膜损伤大鼠模型，检测胃黏膜p-ERK1/2蛋白表达，发现其ERK1/2磷酸化逐步上升，表明在损伤的胃黏膜组织自我修复过程中启动了细胞增殖活动，促进溃疡的愈合。

本研究发现，慢性应激与Hp感染双重因素对于小鼠胃黏膜的损伤超过了慢性应激或Hp感染单一因素对小鼠的影响，肝胃百合汤治疗后，模型小鼠Hp感染和胃黏膜损伤均明显改善，TFF1、p-ERK蛋白表达升高，说明慢性应激与Hp可协同致胃黏膜损伤，肝胃百合汤对慢性应激合并Hp感染胃溃疡有明显的抑制和促进愈合的作用，其机制可能与肝胃百合汤通过促进TFF1、p-ERK表达及胃黏膜修复，减轻胃黏膜炎症等因素有关。

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