用高效液相色谱法检测阿奇霉素糖浆中阿奇霉素含量的效果研讨

范 馨 ，石颖欣 ，屠宝英，董 馨

（1.广东华润顺峰药业有限公司，广东 深圳 518110；2.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110）

阿奇霉素糖浆是临床上应用较为广泛的新一代大环内酯类抗生素之一[1-3]。该药主要用于治疗急性咽炎、急性扁桃体炎、鼻窦炎、中耳炎、急性支气管炎等疾病。在国家药品标准WS1-(X-135)-2003Z中，检测阿奇霉素含量的方法为抗生素微生物检定法。有研究表明，该方法的操作繁琐，耗时长，且检测的结果较不稳定[4-5]。在USP26版《美国药典》和416版《欧洲药典》中，检测阿奇霉素含量的方法均为高效液相色谱法[6]。本文主要探讨用高效液相色谱法测定阿奇霉素糖浆中阿奇霉素含量的方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

本次实验所用的仪器为Agilent 1100型高效液相色谱仪、Dionex U3000型高效液相色谱仪、Starious十万分之一天平（生产企业为赛多利斯科学仪器公司，型号为CPA225D）、超纯水机（生产企业为广州东锐科技有限公司，型号为SIMPLICITY185）和超声波清洗机（生产企业为上海新苗医疗器械制造有限公司，型号为BX3200H）。

1.2 试剂

本次实验所用的试剂为阿奇霉素对照品（生产企业为中国食品药品检定研究院，批号为130593-201303）、阿奇霉素糖浆（生产企业为广东华润顺峰药业有限公司，批号为 20170301、20170302、20170303，规格为 50 ml:1.0 g）、色谱纯甲醇（生产企业为德国MERCK，批号为I847607636）、色谱纯乙腈（生产企业为德国MERCK，批号为 JA042930）。

2 方法

2.1 色谱条件

本次实验选用Waters XBridge Shield RP18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）。将柱温设置为30℃；将流量设置为1.0 ml·min-1；将进样量设置为50 μl；将检测波长设置为210 nm；将流动相的比例设置为乙腈-磷酸盐缓冲液（45:55）。磷酸盐缓冲液的制作方法是：取0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液，用浓度为20%的磷酸溶液调节pH值至8.2。

2.2 溶液的配置

2.2.1 阿奇霉素标准品溶液的制备 精密称取阿奇霉素糖浆5 ml。然后，将5 ml的阿奇霉素糖浆与甲醇、水（甲醇与水的比例为1:1）进行溶解。精密称取50 μl的阿奇霉素标准品溶液，将其注入液相色谱仪，并记录色谱图。

2.2.2 阿奇霉素对照品溶液的制备 精密称取阿奇霉素对照品10 mg，将其放入 10 ml的容量瓶中后，加入 1 ml的甲醇，充分摇匀使其溶解。然后，再加入甲醇、水（甲醇与水的比例为1:1），稀释至刻度线。精密称取50 μl的阿奇霉素对照品溶液，将其注入液相色谱仪，并记录色谱图。

2.2.3 阿奇霉素对照品储备液的制备 精密称取阿奇霉素对照品0.25 g，将其放入25 ml的容量瓶中后，加入甲醇、水（甲醇和水的比例为1:1）进行溶解。

2.2.4 阿奇霉素阴性对照溶液的制备 按照阿奇霉素糖浆的制备工艺制备阿奇霉素阴性对照溶液。阿奇霉素阴性对照溶液的制备方法同阿奇霉素对照品溶液的制备方法。精密称取50 μl的阿奇霉素阴性对照溶液，将其注入液相色谱仪，并记录色谱图。

2.3 各溶液色谱行为

实验的结果显示，阿奇霉素标准品溶液和阿奇霉素对照品溶液中阿奇霉素的出峰时间为12 min，而阿奇霉素糖浆阴性对照溶液未出峰。分别对阿奇霉素标准品溶液和阿奇霉素对照品溶液进行酸碱破坏、光线破坏、氧化破坏和高温破坏，其主峰旁相邻的杂质峰与主峰的分离度符合要求，阿奇霉素标准品溶液主峰旁未出现干扰峰。由此可见，该检定方法的专属性较强。详情见图1～3。

图1 阿奇霉素标准品溶液色谱图

图2 阿奇霉素糖浆阴性对照液色谱图

图3 阿奇霉素糖浆对照品色谱图

2.4 耐用性试验

2.4.1 流动相pH值的影响 分别配制pH值为8.0、8.2、8.4的磷酸盐缓冲液，并将不同pH值的磷酸盐缓冲液与乙腈进行混合（磷酸盐缓冲液与乙腈的比例为45:55）配制成三种不同pH值的流动相。在阿奇霉素对照品溶液和阿奇霉素标准品溶液中加入流动相进行溶解，稀释至刻度线后进行测定。实验的结果显示，阿奇霉素的峰面积随着pH值的降低而逐渐变小。这三种不同pH值的流动相RSD（相对标准偏差）均为0.5%，流动相的平均pH值为（8.2±0.2），理论塔板数符合质量标准的规定及要求。

2.4.2 流动相比例的影响 配制pH值为8.2的磷酸盐缓冲液，并将其与乙腈按照不同的比例（40:60、45:55、50:50）进行混合，配制成三种不同比例的流动相。在阿奇霉素对照品溶液和阿奇霉素标准品溶液中加入流动相进行溶解，稀释至刻度线后进行测定。实验的结果显示，随着乙腈比例的逐渐增加，阿奇霉素的峰值越高，其峰面积越大。这三种不同比例的流动相RSD均为0.6%，流动相乙腈的平均比例为（55±5）%，理论塔板数符合质量标准的规定及要求。

2.4.3 柱温的影响 在柱温为25℃、30℃、35℃的情况下，分别对阿奇霉素标准品溶液与阿奇霉素对照品溶液进行分析。实验的结果显示，柱温越低，阿奇霉素出峰的时间越早。这三种不同柱温的流动相RSD均为0.4%，流动相柱温的平均温度为（30±5）℃，理论塔板数符合质量标准的规定及要求。该实验表明，此方法的耐用性较强。

2.5 线性关系考察

精密称取 0.5 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4 ml和1.5 ml的阿奇霉素对照品储备液，并分别将其放置在10 ml的容量瓶中，然后分别加入甲醇和水(甲醇和水的比例为1:1)进行溶解，并稀释至刻度线。分别取不同浓度的20μl阿奇霉素对照品储备液注入液相色谱仪。实验的结果表明，阿奇霉素对照品储备液的浓度为0.5 mg·ml-1～1.5mg·ml-1，与阿奇霉素峰面积的积分呈良好的线性关系。详情见表1。以阿奇霉素浓度为横坐标，所得其峰面积为纵坐标，得线性回归方程为y = 3434.5x + 88.46（R²=1.0000）。详情见图4。

表1 阿奇霉素浓度与峰面积的标准曲线

图4 阿奇霉素标准曲线

2.6 阿奇霉素对照品溶液的回收率实验

精密称取 20 mg、25 mg、30 mg 的阿奇霉素对照品溶液，将其加入到25 ml的容量瓶中后，再加入1 ml的阿奇霉素糖浆，然后，使用流动相进行溶解，并稀释至刻度线。实验的结果显示，阿奇霉素对照品溶液的回收率为99.56%～103.59%，符合回收率的规定限度（92%～105%）。详情见表2。

表2 阿奇霉素对照品的回收率（例数=9）

2.7 阿奇霉素标准品溶液和阿奇霉素对照品溶液稳定性的实验

在室温条件下，将阿奇霉素标准品溶液和阿奇霉素对照品溶液分别放置 0 h、8 h、12 h、21 h 后进行分析。实验的结果表明，在21 h内，阿奇霉素标准品溶液和阿奇霉素对照品溶液均未发生变色、沉淀等异常现象，其RSD＜1.0%。在21 h后，阿奇霉素对照品溶液的RSD＞1.0%。可见，阿奇霉素标准品溶液和阿奇霉素对照品溶液在配制后的12 h内较为稳定。详情见表3。

表3 阿奇霉素标准品溶液和阿奇霉素对照品溶液稳定性的结果

2.8 阿奇霉素标准品中阿奇霉素含量的测定

精密称取5 ml的阿奇霉素糖浆（生产批号分别为20170301、20170302、20170303），将其加入到 100 ml的容量瓶中后，再向容量瓶中加入甲醇和水（甲醇和水的比例为1:1），使其溶解并稀释至刻度线。实验的结果显示，阿奇霉素标准品中阿奇霉素的含量为104.42%～104.79%。详情见表4。

表4 阿奇霉素标准品中阿奇霉素含量的测定（例数=3）

3 讨论

在2015版药典中，阿奇霉素糖浆及其制剂所用的溶剂多为乙腈，但实验证明，阿奇霉素糖浆与乙腈不相溶，因此，本次研究中选用甲醇做为溶剂。阿奇霉素糖浆在甲醇中能够有效地好溶解，但溶解后的溶液易在过夜后析出晶体。通过使用溴化钾压片对该晶体进行红外光谱检测后发现，该晶体与蔗糖的光谱图相一致，故确定析出的晶体为蔗糖。根据蔗糖在水中极易溶解的特点，本研究中将溶剂确定为甲醇和水。本次实验的结果显示，阿奇霉素糖浆在甲醇和水（1：1）中的溶解性良好，放置3天阿奇霉素标准品溶液仍能保持澄清，且无结晶析出。但阿奇霉素对照品在甲醇和水中需要使用超声才能够有效溶解，故本实验在进行阿奇霉素对照品溶液制备时，先加1 ml甲醇使阿奇霉素快速溶解，然后再加入甲醇和水稀释至刻度线。本次实验按照2015年版药典中记载的测定阿奇霉素含量的色谱条件、流动相和检测波长为操作依据。由于阿奇霉素糖浆属于碱性物质，因此，本次实验中选择使用耐碱性的色谱柱。进行实验前，通过对比Waters XBridge TM C18 色 谱 柱（4.6×250 mm，5μm） 与资生堂C18柱发现，前者的色谱峰峰形良好，出峰时间较短，故选用 Waters XBridge TM C18 色谱柱。本次实验的结果显示，阿奇霉素对照品溶液和阿奇霉素标准品溶液的浓度均为 0.5 mg·ml-1～ 1.5 mg·ml-1，与阿奇霉素峰面积的积分呈良好的线性关系。阿奇霉素对照品溶液的回收率为99.56%～103.59%。这说明，高效液相色谱法可用于检测阿奇霉素糖浆中阿奇霉素的含量。