枸杞多糖提取工艺优化及不同产地枸杞质量比较

彭 浩， 秦宏伟， 程有君， 刘正华， 李彦连， 宋文路

(1.济宁学院生命科学与工程系，山东曲阜 273155； 2.山东博康中药饮片有限公司，山东青州 262500)

枸杞果实枸杞子为我国传统的宝贵中药材，具有补肾养肝、润肺明目、益精、补血等功效[1]。《中华人民共和国药典》2015版[2](以下简称《药典》)中枸杞子项下规定水分不得超过13%，总灰分不得超过5%，浸出物不得少于55%，以此作为评价枸杞子药材质量的标准。同时，枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强免疫、保护视网膜、保护生殖系统、治疗骨质疏松等作用[3-6]，为《药典》规定检测的主要药用活性成分，它的含量差异亦体现了枸杞品质的差异。近年来枸杞种植面积不断扩大，产区已由道地主产区宁夏扩大到河北、内蒙古、甘肃、陕西、山西、新疆等省(自治区)[7]。枸杞原料的产地来源与产品的品质密切相关，不同产地的枸杞品质存在不同程度的差异，低温、高海拔、长日照有益于枸杞中主要活性成分的积累[8]。枸杞多糖提取的常用方法是热水浸提法，但热水浸提法提取时间长、耗能多。超声波辅助提取法因超声波产生的强烈振动、空化效应、搅拌作用等可以加速植物有效成分进入溶剂，提高提取率，缩短提取时间，简化操作步骤，在天然产物提取中显示出了巨大优势[9-11]。本试验选用超声波辅助法提取枸杞多糖，并通过正交试验进行优化，以期为该成分的开发利用提供依据。同时，以宁夏和河北栽培的枸杞为材料，对它们的水分、总灰分、浸出物及多糖提取率进行测定分析与比较，以此作为中药选材的依据。

1 材料

试验仪器为101A-1型电热鼓风干燥箱(上海市实验仪器总厂)、SX-4-10型箱式电阻炉(北京永光明医疗仪器总厂)、万用电炉(一联北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、DRHH-54型数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)、BF-Ⅲ型薄层电动涂铺器(天津市思利达科技有限公司)、ZF-6型(三用紫外仪上海市金鹏分析仪器有限公司)、L6S型紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)、KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。试验用枸杞子分别产自宁夏和河北，并经过济宁学院生命科学与工程系李彦连副教授鉴定为茄科枸杞属植物枸杞(Lyciumbarbarum)的果实——枸杞子，低温干燥避光保存；D-无水葡萄糖(含量为99.5%)和枸杞子对照药材(均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为1108—2025、121072—201410)，其他试剂均为分析纯(AR)。本试验于2017年6月在山东博康中药饮片有限公司及济宁学院生命科学与工程系进行。

2 方法与结果

2.1 LBP提取工艺流程

称取干燥河北枸杞子粗粉0.5 g加入80%乙醇100 mL，加热回流1 h，过滤，80%乙醇分次洗涤滤渣。滤渣中加入蒸馏水，超声波处理，回流。过滤并冷却后，蒸馏水定容至250 mL。

2.2 标准曲线的制备

多糖测定采用改进的苯酚-硫酸法[12]。使用葡萄糖标准品精确配制浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。依次量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准溶液，用蒸馏水定容至 2.0 mL。各加入1 mL 5%的苯酚、5 mL浓H2SO4，40 ℃水浴中保温15 min，冷却至室温，于490 nm处测吸光度。以葡萄糖浓度作为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2.3 LBP提取率的测定

根据葡萄糖标准曲线制作方法测定容后的枸杞多糖溶液吸光度，根据式(1)计算枸杞多糖提取率。

枸杞多糖提取率=CVD/m×100%。

(1)

式中：C为根据标准曲线求得的多糖浓度，g/mL；V为样品溶液的定容体积，mL；D为枸杞多糖的稀释倍数；m为枸杞原料质量，g。

2.4 单因素试验设计

影响枸杞多糖提取率的因素比较多，如料液比、提取温度和时间、提取次数、pH值等。以超声波作为多糖样品的辅助提取方法，单因素试验设计如下：

2.4.1 料液比对LBP提取率的影响 固定超声时间为 30 min，加热回流提取时间为60 min，测定料液比分别为 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60(g ∶mL)时的多糖提取率，结果如图1所示。

由图1可知，多糖的提取率随着料液比的增加而逐渐增大。这是由于溶剂的增加有利于多糖的扩散传质，从而增加多糖的提取率[13]。当料液比达1 g ∶40 mL后，随着水量的增加，提取率增加不明显，而且当料液比超过1 g ∶50 mL后，过多的溶剂则会消耗大量超声波辐射能量，影响多糖的析出，因而提取率呈现下降的趋势。所以提取料液比选取在 1 g ∶40 mL 左右。

2.4.2 回流时间对LBP提取率的影响 固定料液比 1 g ∶40 mL，超声时间为30 min，测定加热回流提取时间分别为30、60、90、120、150、180 min时的多糖提取率，结果如图2所示。

由图2可知，随着回流时间的增加，多糖的提取率也在增加，且在120 min内增加显著，之后趋于平缓。本着节能原则，回流提取时间在120 min左右为宜。

2.4.3 超声时间对LBP提取率的影响 固定料液比 1 g ∶40 mL，加热回流提取时间为120 min，测定超声时间分别为30、45、60、75、90、105 min时的多糖提取率，结果如图3所示。

由图3可知，在超声时间为30～60 min之间时，多糖提取率随超声时间的增加而上升，但是当超声时间超过60min后提取率缓慢下降。超声波时间短使多糖不能充分溶解，但超声波处理时间过长其强剪切作用使大分子多糖断裂，造成多糖的损失[14]。所以超声时间应选取在60 min左右。

2.5 正交试验设计

根据单因素试验的结果，选取料液比、超声时间、回流时间3个因素的各3个适宜水平(表1)，按L9(34)进行正交试验[12]，优化提取工艺，确定最佳提取工艺条件，结果如表2所示。

表1 正交试验因素与水平

表2 L9(34)正交试验结果

2.6 LBP提取率方差分析

为进一步确定超声波辅助法提取LBP的最佳工艺条件，评估和判断试验误差和条件对试验结果的影响，利用SPSS 19.0软件进行方差分析，结果如表3所示。由表2和表3可知，料液比、回流时间、超声时间都会影响LBP提取率，且均达到了显著水平(P<0.05)。由于RC>RA>RB，所以超声时间对提取率影响最大。由k值可知最优水平为A3B2C3，即料液比1 g ∶50 mL、回流时间120 min、超声时间70 min。

表3 方差分析

注：“**”表示差异显著(P<0.05)。

2.7 验证试验

对通过正交试验得出的最佳工艺条件进行验证试验，3次平行试验的提取率平均值为(9.06±0.23)%，接近预期值，且显著高于其他条件下的LBP提取率。

2.8 不同产地枸杞的质量评价

选用水分、总灰分、浸出物和多糖提取率作为评价指标，对河北枸杞子和宁夏枸杞子进行质量评价。将干燥枸杞子粉碎，过二号筛[24目，筛孔内径为(850±29) μm]备用。

2.8.1 水分测定法 参照《药典》中的烘干法进行测定，精确称取2种枸杞子粉末各3份，每份2 g，计算供试样品含水量(%)，结果如表4所示。由表4可知，2种枸杞子的水分均符合《药典》中不得超过13.0%的要求。

2.8.2 总灰分测定 参照《药典》中的总灰分测定方法进行测定，精确称取2种枸杞子粉末各3份，每份2 g，计算供试品中总灰分的含量(%)，结果如表4所示。由表4可知，2种枸杞子的总灰分测定均低于《药典》5.0%的要求。

表4 不同产地枸杞中水分、总灰分、浸出物及多糖提取率

2.8.3 浸出物测定 参照《药典》中的热浸法进行浸出物测定，精确称取2种枸杞子粉末各3份，每份4 g，计算浸出物的含量(%)，结果如表4所示。由表4可知，2种枸杞子的浸出物含量均符合《药典》中不得少于55.0%的规定标准。

2.8.4 糖类的定性鉴别 干燥的枸杞子粉末0.5 g，加水溶解至50 mL后将其置于加热套中加热回流15 min，冷却过滤后滤液置于梨形分液漏斗中加入15 mL乙酸乙酯萃取，将萃取的乙酸乙酯液转移至蒸发皿中沸水浴浓缩至1 mL，得到供试品溶液。采用同样的方法制备枸杞对照药材溶液，作为对照。按照薄层色谱法试验，各吸取5 μL供试品溶液和对照溶液分别点至同一硅胶G薄层板，将其放置在展缸中，加入展开剂(比例为3 ∶2 ∶1的乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸)，展开，至8 cm后小心取出晾干，将硅胶薄板置于紫外光灯(365 nm)下检视。由图4可知，2种枸杞子中均含有多糖成分。

2.8.5 枸杞多糖提取率测定 按照“2.6”节优化出的最佳工艺条件分别提取2种枸杞多糖，并进行提取率测定。由表4可知，宁夏枸杞多糖提取率明显高于河北枸杞。

2.8.6 2种枸杞多糖的体外抗氧化性分析与比较

2.8.6.1 2种枸杞多糖的总抗氧化能力比较 采用FRAP法[15-16]，分别取1 mL不同质量浓度的2种枸杞多糖水溶液进行测定，空白组以水代替样品，对照组则为同等质量浓度的维生素C溶液。以1.0 mmol/L FeSO4溶液为标准物绘制标准曲线，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需FeSO4的浓度(μmol/L)表示，定义为FRAP值，结果如图5所示。

由图5可知，宁夏枸杞和河北枸杞多糖总抗氧化能力随着质量浓度的增加而逐渐增强，当质量浓度为25 mg/mL时，其总抗氧化能力分别达到99.39、86.25 μmol/L，说明2种枸杞多糖均具有一定的总抗氧化能力。但与同质量浓度的维生素C相比，枸杞多糖的FRAP值较小，说明总抗氧化能力略小。此外，在相同质量浓度下，宁夏枸杞总抗氧化能力显著高于河北枸杞。

2.8.6.2 2种枸杞多糖对DPPH自由基的清除能力比较 参考Atoui等的测定方法[16-17]，分别取1 mL不同质量浓度的2种枸杞多糖的水溶液进行试验，空白组以水代替样品，对照组则为同等质量浓度的维生素C。DPPH自由基清除率按式(2)计算，结果如图6所示。

(2)

式中：D1为样品组的吸光度，D0为空白组的吸光度。

由图6可知，质量浓度在0～25 mg/mL范围内，2种枸杞多糖对DPPH自由基的清除率随样品质量浓度升高而增大。当质量浓度为25 mg/mL时，宁夏枸杞和河北枸杞多糖对DPPH自由基清除率达到最大值，分别为60.98%和56.39%，说明2种枸杞均具有一定的DPPH自由基清除能力。与同质量浓度的维生素C标准品相比，2种枸杞多糖对DPPH自由基的清除率略小，但在相同质量浓度下，宁夏枸杞多糖对DPPH自由基清除能力明显高于河北枸杞多糖。

2.8.6.3 2种枸杞多糖对羟自由基的清除能力比较 采用 2- 脱氧核糖法[16，18]，分别取500 μL不同质量浓度的2种枸杞多糖的水溶液进行试验，空白组以水代替样品，对照组则为同等质量浓度的维生素C。DPPH自由基清除率按式(3)计算，结果如图7所示。

(3)

式中：D1为样品组的吸光度，D0为空白组的吸光度。

由图7可知，质量浓度在0～25 mg/mL范围内，2种枸杞多糖对羟自由基的清除率随样品质量浓度升高而增大。在25 mg/mL时，宁夏枸杞和河北枸杞多糖对羟自由基清除率达到最大值，分别为82.02%和81.96%。2种枸杞多糖羟自由基清除能力差异不明显，但均略大于同质量浓度下维生素C的羟自由基清除率，说明2种枸杞多糖具有较强的羟自由基清除能力。

3 结论

通过单因素试验和SPSS 19.0软件对LBP提取条件进行了正交试验优化，得到优化后的工艺条件为料液比 1 g ∶50 mL，回流时间120 min、超声时间70 min。各因素对LBP提取率的影响顺序为超声时间>料液比>回流时间，验证试验的结果与预测值接近，表明通过正交试验所得的优化条件稳定、可靠。同时，比较了不同产地枸杞水分、总灰分、浸出物和多糖提取率。从测定结果可以看出，宁夏枸杞和河北枸杞均符合药典标准，但二者多糖提取率差别较大，其中，采用优化工艺提取并测定的宁夏枸杞多糖提取率更高，达21.39%，且宁夏枸杞多糖的抗氧化活性优于河北多糖。近年来枸杞配方的中药产品逐年增加，大多数取其补益和增强免疫功能的作用，产品的功效与枸杞多糖抗氧化活性有密切的关系，本试验的结果能为枸杞多糖的开发利用、有关厂家选择用药及适当调整枸杞用药剂量提供可参考的依据。