川芎平喘合剂对COPD相关肺动脉高压大鼠NO、ET-1的影响*

郭晓燕，钱家骅，徐向前，范春香，张惠勇

上海中医药大学附属龙华医院肺病科，上海 200032

肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的重要并发症，是COPD发展至慢性肺源性心脏病的重要病理生理过程，肺动脉压(PAP)持续升高，可致右心负荷增加，最终发生右心衰竭，是影响COPD患者疾病进程的独立危险因素［1］。近年研究显示，COPD肺组织缺氧，肺血管功能受损，在内皮细胞合成、分泌的一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)失衡，导致肺血管收缩增强、舒张减弱，引起PAH。本研究拟通过建立COPD相关肺动脉高压模型，探讨川芎平喘合剂对大鼠肺动脉压的作用及对NO、ET-1的影响，揭示川芎平喘合剂的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD大鼠60只，清洁级，体质量(200±20)g，购自上海斯莱克动物实验中心，饲养于上海中医药大学动物实验中心，实验动物合格证号：SCXK(沪)2014-008。所有大鼠在同一动物房中饲养，温度(25±l)℃，湿度28%的环境中适应性饲养1周后进行实验。

1.2 实验药物 川芎平喘合剂，药物组成：川芎12 g，赤芍18 g，白芍 18 g，当归 9 g，丹参 9 g，黄荆子9 g，胡颓叶 18 g，细辛 5 g，辛夷 5 g，生甘草6 g，取上述药物制成液体制剂，其终浓度为每毫升含生药量为1.526 g(1.526 g/mL)，由上海中医药大学附属龙华医院制剂室提供。将川芎平喘合剂根据成人日服剂量，通过公式 D1∶D2=R1∶R2，按动物体表面积比率换算等效剂量，其中D：剂量，R：体表面积。计算出大鼠日服量：9.81 g/(kg·d)。盐酸法舒地尔注射液(天津红日药业有限公司规格，2 mL∶30 mg)。

1.3 主要试剂与仪器 自制有机玻璃烟薰箱(60cm×40 cm×80 cm)；中南海牌香烟(焦油含量10 mg/支)；气体浓度检测仪(河南中安电子探测技术有限公司)；RM6240型多道生理信号采集系统(成都仪器厂)；酶标仪(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo)；电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；离心机型号(上海安亭科学仪器厂)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；ET-1 ELISA试剂盒(美国Phoenix)；NO酶法试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.4 模型制备 参照许浒、蒋明等［2-3］复制COPD相关肺动脉高压动物模型。采用烟熏联合脂多糖复制COPD模型，将大鼠放入自制有机玻璃舱，第1、14 天气道内注入脂多糖(LPS)200 μg，每天舱内烟熏4次共2小时(15支/次，30 min/次，第1、14天除外)，连续6周，从第5周开始，舱内烟熏同时叠加每天吸入18%低氧8小时，每周6天，连续2周。

1.5 分组与给药 将SD大鼠按随机数字表法随机分为4组，分别为：对照组、模型组、川芎平喘合剂组、法舒地尔组，每组15只。各组均从第7周即造模成功后给予药物治疗，川芎平喘合剂组给予川芎平喘合剂9.81 g/(kg·d)灌胃，法舒地尔30 mg/(kg·d)腹腔注射，对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，持续2周。

1.6 观察指标

1.6.1 肺动脉压 参照孙波等［4］检测方法，行

右心导管术测大鼠肺动脉压。用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，颈部正中作长约1.5 cm的纵行切口，并游离右颈外静脉约1 cm，结扎，剪口，用一充盈肝素溶液的聚乙烯管经颈静脉缓慢插管至右心房、右心室及肺动脉，导管另一端连接压力传感器至Medlab生物信号采集系统，根据压力波形确定导管位置，记录平均肺动脉压力(mPAP)。

1.6.2 右心指数 测定肺动脉压力结束后，立即完整取出心脏和肺脏，分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+S)，并依次称重，计算右心肥大指数(RVHI)=RV/(LV+S)。

1.6.3 NO、ET-1 各组大鼠肺动脉压力测定结束，腹主动脉取血5 mL，3 000 r/min离心15分钟，取上清液-80℃保存。采用硝酸还原酶法测定NO，酶联免疫吸附法测定ET-1。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件分析数据，计量资料以(±s)表示，符合正态分布采用单因素方差分析，不符合正态分布则采用非参数检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 平均肺动脉压 模型组mPAP高于对照组(P＜0.05)，法舒地尔、川芎平喘合剂组mPAP均较模型组下降(P＜0.05)，川芎平喘合剂组与法舒地尔组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 各组大鼠平均肺动脉压比较(±s) mmHg

表1 各组大鼠平均肺动脉压比较(±s) mmHg

注：与对照组相比＊表示P＜0.05，＊＊表示P＜0.01；与模型组相比，#表示P＜0.05

组别 只数 平均肺动脉压对照组 15 25.05±2.74模型组 15 33.08±3.32＊＊川芎平喘合剂组 15 29.67±2.42＊#法舒地尔组 15 29.18±2.37＊#

2.2 右心指数 模型组、川芎平喘合剂组大鼠RVHI高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，川芎平喘合剂组、法舒地尔组大鼠右心指数与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，川芎平喘合剂组与法舒地尔组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 2。

表2 各组大鼠右心指数比较(±s)

表2 各组大鼠右心指数比较(±s)

注：与对照组比较，＊P＜0.05，＊＊ 表示 P＜0.01

RV/g LV+S/g RVHI组别/%对照组 0.26±0.09 1.45±0.32 0.19±0.08模型组 0.34±0.04 1.26±0.21 0.28±0.06＊川芎平喘合剂组 0.32±0.29 1.19±0.17 0.27±0.11＊法舒地尔组 0.29±0.11 1.18±0.15 0.26±0.12

2.3 NO、ET-1水平 与对照组比较，模型组大鼠NO水平降低，ET-1水平升高(P＜0.05)。川芎平喘合剂组、法舒地尔组均较模型组NO升高，ET-1水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，川芎平喘合剂组与法舒地尔组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 3。

表3 各组大鼠NO、ET-1水平比较(±s)

表3 各组大鼠NO、ET-1水平比较(±s)

组别 NO/(μmol·mL-1) ET-1/(pg·mL-1)对照组 66.65±8.25 132.62±26.00模型组 33.89±5.57＊＊ 251.06±41.25＊＊川芎平喘合剂组 47.56±10.08## 216.04±24.00##法舒地尔组 43.67±9.33# 214.70±28.64#

注：与对照组比较，＊＊P＜0.05，＊＊ 表示P＜0.01；与模型组比较，#表示P＜0.05，##P＜0.01

3 讨论

根据COPD相关PAH、肺心病的临床表现，多将其归于“咳嗽”“肺胀”“喘证”等范畴。早期病变首先在肺，因肺脏反复受邪，外邪侵袭，肺失宣降，宣降失司，气机阻闭，痰浊内蕴，壅阻气道，肺气上逆而致咳嗽、咯痰、喘息、胸闷等不适，后期久咳久喘致喘悸不宁，心气、心阳虚衰，心脉瘀阻，则肺病及心。早期以痰浊为主，渐而痰瘀互见，终至痰浊、血瘀错杂为患，痰瘀阻肺是发病的主要病理机制。

川芎平喘合剂由全国名老中医邵长荣教授结合多年临床经验研制，具有活血化瘀、止咳平喘等作用。本研究结果表明，模型组大鼠肺动脉压升高，右心指数升高，川芎平喘合剂组、法舒地尔组肺动脉压较模型组下降，右心指数有下降趋势，表明川芎平喘合剂能降低COPD相关PAH大鼠肺动脉压力。现代研究显示，川芎有效成分川芎嗪能够恢复动态平衡，并将血管的通透性降低，改善缺氧状态，保护肺血管［5］；赤、白芍成分芍药苷具有抗凝血、扩血管作用［6］；胡颓子叶乙酸乙酯、正丁醇提取物有镇咳、平喘、祛痰作用［7］；当归对PAH有作用，并可降低右室肥厚［8］。NO是体内发现的第一个气体信号分子，是由内皮细胞产生、分泌的血管舒张因子，与可溶性鸟苷酸环化酶结合，提高cGMP水平，舒张肺血管，抑制平滑肌收缩，降低肺动脉压力，维持肺循环稳定［9］。适量的NO能舒张血管，抑制平滑肌细胞增殖，当过量表达时，可与Hb结合形成亚硝酸巯基醇化合物，损伤肺组织细胞，导致PAH升高［10］。合并PAH的COPD患者肺动脉内源性NO产生减少，NO水平降低，使生长因子表达增加，促进肺血管细胞增生，表现为肺动脉内膜增厚、中层肥厚，肺血管收缩［11］，是PAH产生的重要因素。Mealy MA等［12］研究证实，NO吸入疗法能迅速降低PAH，但是对于NO吸入治疗浓度尚缺乏统一标准。适量浓度吸入NO可降低新生儿PAH，对患者凝血机制无明显影响。ET-1由血管内皮细胞合成、分泌，分泌增加可持续收缩血管，促进肺血管平滑肌增殖，是PAH发病的关键物质［13］。COPD合并PAH的患者呼出气中冷凝液和(或)血循环中ET-1水平升高，而且呼出气冷凝液或动脉中ET-1浓度与肺动脉收缩压或平均压显著相关［14］。陈建丽等［15］研究显示，COPD合并PAH患者血清ET-1高于正常组及无PAH的COPD患者，且ET-1与肺动脉压呈正相关，提示ET-1在COPD继发性PAH形成机制中起重要作用。同时，PAH刺激ET-1生成增多，清除减少，ET-1促进PAH的形成和发展，二者相互影响，互为因果。本研究结果表明NO与ET-1在COPD相关PAH发病中具有显著作用，川芎平喘合剂组可降低COPD相关PAH中ET-1水平，升高NO水平，调节肺动脉血管的舒张与收缩，降低肺动脉压力。