益气活血中药对慢性心衰大鼠NT-proBNP和cTnI的影响

康 伊，张 艳，张 伟

（1.辽宁中医药大学，沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110032）

慢性心力衰竭（Chronic heart failure，CHF）被认为主要与血流压力改变引发冠状动脉血管重塑有关[1]。心脏重塑常被认为是一种不可逆的心脏病，与预后不良有关。益气活血中药组方已报道可提高气虚血瘀型慢性心衰患者的生活质量和运动耐力[2]，但采用哪种生化指标检测和衡量益气活血中药组方的治疗效果还有待研究。N末端B型利钠肽前体（Nterminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）和心肌肌钙蛋白I（Cardiac troponin I，cTnI）都是目前慢性心力衰竭临床诊断过程中有效、灵敏的生化检测指标[3-4]。血清NT-proBNP在心室扩张及容量负荷过重时分泌增加，在心肌细胞受到拉伸刺激后pro-BNP在蛋白酶的作用下等摩尔量裂解为无活性NT-proBNP。NT-proBNP是目前在管理心衰疾病中的鉴别诊断、危险评级、预后判断和治疗监测中有重要意义。血清cTnI则是反映心脏损伤的高敏感性、高特异性标志物，当心肌受损后，cTnI对于心衰患者预后预测具有重要意义[5]。本研究通过观察益气活血中药对慢性心力衰竭模型大鼠的疗效，检测不同中西药处理后慢性心衰大鼠血清NT-proBNP和cTnI水平，探索衡量和评估益气活血中药组分对慢性心衰治疗的重要生化指标。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 使用辽宁长生生物技术有限公司提供的、经检测健康的SPF级雄性SD大鼠80只。

1.2 仪器与设备 赖诺普利片（批号：HI0960265）购自上海阿斯利康有限公司，每片10 mg；益气活血中药：由人参、丹参、黄芪、三七粉、红花五味中药组成；中药复方制剂：购自江阴天江药业有限公司。NT-proBNP测定采用酶联免疫（ELISA）法，试剂盒由美国ADL公司提供。cTnI的测定采用电化学发光法，试剂盒购自德国罗氏诊断有限公司。小动物呼吸机HX-300，购自广州深华生物技术有限公司。彩色多普勒超声机SONO S5500购自Agilnet公司。酶标仪购自上海皓庄仪器有限公司。电热鼓风干燥箱，由天津泰斯特仪器有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 心衰大鼠模型构建 随机选取20只大鼠作为空白组，剩余60只大鼠进行左前降支动脉结扎手术[6-7]：按照0.3 mL/100 g比例腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，取仰卧位固定于手术台上，经口自声门插入气管，外联HX-300小动物呼吸机,呼吸频率为80次/min，潮气量为0.8 mL。用碘酒消毒术区，定位第3肋，并以左胸第3肋间为切口，逐层切开皮肤、胸大肌，暴露肋骨，利用开胸器扩胸后，在左心耳和肺动脉圆锥之间找到左冠状动脉前降支，并在其起源点下2～4 mm处用美容线结扎，当周围心肌变白时，将心脏重置于胸腔，清理好胸腔内淤血和外源污染物。使用3号线逐层关胸，皮下注射5 mL生理盐水，在暖灯下等待呼吸状态平稳后停小动物呼吸机，观察大鼠自主呼吸后，拔出气管插管针。将大鼠四肢插入电针，进行心电图显示胸导ST-T段抬高表明结扎成功。术后1次/d、连续3天注射青霉素钠3万单位抗感染治疗。术后存活大鼠常规喂养一周后，采取半量饲料饥饿喂养，每天力竭式游泳一次，时间随大鼠状态逐步缩短，持续4周。训练期间模型大鼠出现精神萎靡，活动度减低，脱毛，喉间哮鸣音等体征。通过心脏彩照检测左室射血分数（EF）≤50%作为慢性心衰造模成功标准，列入下一步实验对象。

1.3.2 分组及给药 建模手术成功41只大鼠随机分为建模组（13只）、赖诺普利组（14只）和益气活血组（14只）。同时空白组通过随机抽取法留取15只大鼠。空白组和建模组分别进行等容积蒸馏水灌胃，1次/d。赖诺普利组和益气活血组按照人鼠剂量换算公式给药。赖诺普利组按生药1.5 mg（ /kg/d） 的剂量给予赖诺普利，灌胃，1次/d，益气活血组按生药4.6 g生药/（kg/d），灌胃，1次/d。各组均持续给药28 d。

1.3.3 取材及检测方法 由于灌胃给药期间建模组和治疗组大鼠出现不同程度的死亡，每组大鼠剩余数目仍大于等于10只，因此，在后期的实验中每组大鼠再次采用随机数字表法各取10只进行检测。大鼠持续给药28 d后，经过禁食不禁水处理12 h后，麻醉处死全部大鼠。通过腹主动脉取血4 mL，在室温条件下自然凝固20 min，3 000 r/min离心20 min。仔细收集上清液，低温保存。

1.3.4 血清NT-proBNP测定 依照NT-proBNP试剂盒说明书步骤操作对标准品依次进行稀释、加样、温育、配液、洗涤、加酶、显色，在450 nm波长下，测定各孔的吸光度（OD值），最后计算样品实际浓度。

1.3.5 血清cTnI测定 采用电化学发光免疫法在Roche cabas E601 全自动免疫分析仪上检测，试剂盒购于Roche公司。

1.4 统计学方法 使用SPSS 17.0软件对所有数据进行统计分析，结果使用均数±标准差（± s ）形式表示，使用完全随机分组法进行组间比较，如果方差不齐采用Dunnett检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 利用血清NT-proBNP水平验证检测益气活血中药组方疗效，见表1和图1。

建模组比和空白组相比，血清NT-proBNP水平明显升高（P＜0.01），表明建模组血清NT-proBNP水平明显高于空白组，证明慢性心力衰竭时NT-proBNP含量呈增高趋势。益气活血组和赖诺普利组与建模组比较，大鼠血清中NT-proBNP水平都显著降低（P＜0.01），而益气活血组与赖诺普利组组间比较血清NT-proBNP水平没有统计学意义（P＞0.05），说明益气活血中药与赖诺普利片的疗效基本相当。以上数据表明益气活血中药和西药赖诺普利片对慢性心力衰竭大鼠均有治疗作用并且都能显著降低血清NT-proBNP的水平。

表1 各组大鼠血清中NT-proBNP含量（± s ）

表1 各组大鼠血清中NT-proBNP含量（± s ）

注：与空白组比较，# P＜0.01；与建模组比较，△P＜0.01

组 别 n NT-proBNP（ng/mL）空白组 15 0.35±0.05建模组 13 1.56±0.11#益气活血组 14 1.06±0.07#△赖诺普利组 14 1.05±0.08#△

图1 各组大鼠血清NT-proBNP水平的测定和统计分析

2.2 利用血清cTnI水平验证检测益气活血中药组方的治疗疗效见表2和图2。

建模组与空白组相比，血清cTnI水平显著升高（P＜0.01），表明建模组血清cTnI水平含量高于空白组，提示了心力衰竭时cTnI含量呈增高趋势。益气活血组与赖诺普利组与建模组相比较，慢性心衰大鼠血清cTnI水平明显降低（P＜0.01），益气活血组与赖诺普利组组间比较血清cTnI水平没有统计学意义（P＞0.05），表明益气活血中药及赖诺普利片的疗效基本相当。以上数据说明益气活血中药和西药对慢性心力衰竭大鼠均有治疗作用并且明显降低血清cTnI的水平。

表2 各组大鼠血清中cTnI含量（± s ）

表2 各组大鼠血清中cTnI含量（± s ）

注：与空白组比较，# P＜0.01；与建模组比较，△P＜0.01

组 别 n cTnI（pg/mL）空白组 15 154.89±11.55建模组 13 394.50±28.34 #益气活血组 14 282.92±22.93#△赖诺普利组 14 278.89±17.88#△

图2 各组大鼠血清cTnI水平的测定和统计分析

3 讨论

3.1 NT-proBNP、cTnI与慢性心力衰竭的关系 B型利钠肽主要来源于心室释放，表明心脏也是一个内分泌器官。BNP最初是在猪脑中发现的，但后来发现其在心脏中浓度最大。108个氨基酸的pro BNP释放后可被等摩尔裂解成32个氨基酸的活性BNP和76个氨基酸的NT-pro BNP[8]。有活性的BNP进而结合pGC-A受体（particulate guanylyl cyclase A receptor），从而增加第二信使cGMP的浓度，最终起到减少成纤维细胞和平滑肌细胞增殖、降低交感神经活性、促进利尿、血管舒张、抑制心脏肥厚和纤维化、抑制肾素-血管紧张素—醛固酮系统以及代谢保护功能的作用。两种多肽半衰期不同，有活性的BNP主要被脑啡肽酶NEP降解半衰期仅为22 min，而NT-proBNP则不依赖NEP的降解半衰期为2 h。临床上NT-proBNP已经作为诊断和判断慢性心衰预后的重要生物标记物，缬沙坦心力衰竭试验（Val-HeFT研究）证明了NT-proBNP对晚期心力衰竭患者诊断的有效性，NT-pro BNP浓度在NYHAIII 或IV期扩张型心肌病和心血管病患者中显著升高[9]。由Zile等人主导的分析NT-proBNP与心衰患者预后的大型临床分析PARADIGM-HF项目表明，NT-proBNP与心衰患者的预后密切相关[10]。王宝囡等人的研究表明NT-proBNP水平与心衰患者发生猝死或者再次住院高度相关[11]。鉴于血清中NT-pro BNP浓度检测已被证明是非常有效的筛选技术，FDA已经批准利用NT-pro BNP进行评估充血性心力衰竭和急性冠状动脉综合征。

肌钙蛋白（Troponin）复合物由C、T和I三种亚型组成，肌钙蛋白C是钙结合亚基，肌钙蛋白T具有原肌球蛋白结合单元，而肌钙蛋白I蛋白通过抑制肌动球蛋白ATP活性调节肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，是三元复合物中的抑制亚基[12]。cTnI分子量为27 kDa，只在心肌中存在而且控制着薄肌动蛋白对钙离子的反应。在低钙离子条件下，cTnI结合肌动蛋白阻止肌球蛋白与肌动蛋白的结合从而抑制力的产生；而在高钙离子条件下，钙离子通过结合cTnC导致cTnI与肌动蛋白分离，从而肌球蛋白与肌动蛋白结合促使心肌细胞产生收缩力。cTnI具有两个部分：超过90%的心肌钙蛋白I被绑定到肌原纤维中，仅有少部分处于细胞浆中的游离状态。游离状态的cTnI释放入血更加迅速，仅在心肌受损后1～2 h内即有反应[13]。临床观察表明cTnI和T可以迅速释放游离状态的部分，在急性损伤后4～6 h血液含量开始升高，并可以持续6～8 d，因此cTnI可作为检测心肌损伤的敏感指标[14]。除明显的心肌坏死外，cTnI释放另一个例子包括阵发性室上性心动过速后肌钙蛋白升高。相比之下，肌原纤维结合的cTnI在急性损伤几天后才逐步缓慢地释放到血液中[15]。

3.2 益气活血中药对CHF的影响 慢性心衰主要表现为喘息气短、呼吸困难、疲倦乏力、水肿等体肺循环淤血的症状[16]。慢性心衰中医病机总属本虚标实，其以气虚、阳虚、阴虚为本，而尤以气虚为根；以痰浊、血瘀、水饮为标，尤以血瘀为主[17]。现代中医学研究认为，慢性心衰的发生与心肾气虚关系最为密切。心肾气虚是慢性心衰发生的基础，且伴随着慢性心衰的整个过程[18]。“瘀血”与“水肿”均为心肾气虚的病理产物，其中“瘀血”是慢性心衰发生的重要环节[19]，而“水肿”的出现是慢性心衰的严重阶段[20]。“气行血行，气滞则血停”，益气活血中药由黄芪、人参、丹参、三七粉、红花组成：黄芪、人参补气，并具有正性肌力作用等作用；丹参活血化瘀，调血敛血；三七活血止血；红花活血化瘀。诸药合用，起到活血化瘀、补气理气之功效。现代药理学还认为，丹参能够改善能量代谢和抑制细胞凋亡等[21]，为本方能够调节心肌能量代谢提供了药理依据。

4 结论

益气活血中药可以帮助产生心肌代谢所需的能量，减轻心肌损伤，从而改善慢性心力衰竭的症状并且为中医药防治慢性心力衰竭提供客观的科学依据。