猪流行性腹泻病毒S蛋白和M蛋白串联表达的研究

陈 媛, 郑庆礼, 李春燕, 袁晓琴, 王全溪

(福建农林大学动物科学院, 福建 福州 350002)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为主要特征[1].PEDV首次在英国被发现[2],而后在泰国、越南南部、菲律宾、中国等亚洲国家也报道了许多有关PEDV的流行情况.

PEDV的核酸为单股正链RNA，基因组全长为27000～33000个NT，其5′端存在一个帽子结构，3′端则有一个Poly(A)尾[3]，在3′4 kb区域内有4个主要的开放阅读框(ORF)，其中N、sM、以及M等结构蛋白主要由上游ORF3编码，M蛋白是一个可以在病毒粒子的组装和出芽、刺激机体产生免疫、诱导机体产生α-干扰素甚至可以中和病毒(前提是有补体存在)等方面发挥作用且具有高度保守性一种跨膜蛋白，因此把M蛋白列为PEDV基因工程疫苗的候选基因[4].S蛋白是一种糖蛋白，它位于病毒的表面，有识别靶细胞，促进病毒和细胞膜的融合，刺激宿主细胞产生中和抗体等作用，而且，它与病毒在体外的生长有关，能减弱病毒在体外的毒力,在疫苗的领域成为主要目的蛋白用于防治PEDV的爆发.

目前国内外对于单基因和多基因共表达的研究均取得一定进展，如张博等[5]成功构建了PEDV部分N基因原核表达载体，常宏赏等[7]成功构建了pet-32a-S质粒，崔光亚[7]成功构建了串联重组质粒pET-HBHA-HSP65，王国卿等[8]成功构建了PET-32a(+)-2Tβ4，但目前对PEDV的多基因共表达研究仍未见详细报导.

本试验旨在通过构建串联重组质粒，筛选诱导表达的条件，为后期获得重组蛋白、新型疫苗、多克隆抗体以及PEDV致病机理的研究提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

DH-5α和E.coliBL-21感受态细胞购自北京金式金生物技术有限公司，重组质粒Pet-32a-M由本试验构建保存于-20 ℃.

主要试剂有HindⅢ QuickCut、NotⅠ QuickCut限制性内切酶(赛默飞世尔科技公司)，高纯度质粒小提中量试剂盒(维真生物科技有限公司)、RNA提取试剂盒(哈尔滨新海基因检测有限公司).

1.2 引物设计

按照GenBank登录的PEDV S蛋白基因序列(KU363117.1)，选择主要抗原位点并去除稀有密码位置，通过Oligo7设计引物，送至测序公司合成.

上游引物F：5′-GCAAGCTTATGAGCCAACTCAAGTGTT-3′(HindⅢ);下游引物R：5′-ATGCGGCCGCAACACCTGCCAAAAAGC-3′(NotⅠ).

1.3 目的基因扩增

取PEDV阳性病料剪碎并磨成浆液，重复冻融至少3次，以10000离心15 min，吸出上清，用RNA病毒提取试剂盒提取RNA，反转录成 cDNA后,取1 μL作为模板，加10 mmol·L-1PCR Nucleotide Mix 12.5 μL,Nuclease-Free Water 9.5 μL,上下游引物各1 μL.反应条件为95 ℃ 95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35个循环，72 ℃延伸10 min ,进行PCR的扩增，1%琼脂糖凝胶电泳.采用胶回收试剂盒回收PCR产物.

1.4 串联表达载体PET-32a-M-S的构建

用HindⅢ和NotⅠ分别对胶回收产物和Pet-32a-M进行双酶切，80 ℃灭活30 min，按照目的基因∶质粒=7∶1的比例，置4 ℃冰箱T4连接酶过夜连接.

1.5 串联重组质粒鉴定

连接产物转染到DH-5α感受态细胞进行过夜培养，挑取2个白色单克隆菌落，分别以4对引物：目的基因(F、R)、T7(F、R)、目的基因(F)+T7(R)和目的基因(R)+T7(F)进行PCR鉴定.待鉴定正确，扩大培养，提取质粒，进行HindⅢ和NotⅠ酶切鉴定及测序鉴定.经鉴定正确后，将串联重组质粒转化到BL-21中.

1.6 串联蛋白诱导表达体系优化

将保存的阳性克隆菌复苏，按照1∶100的比例接种于LB培养基Amp+，250 r·min-1，37 ℃摇床中培养至D600 nm=1时，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1的IPTG，在时间和T不变的情况下，取15 μL样品跑SDS-PAGE电泳，最后得到最佳的诱导浓度.

最佳诱导浓度和温度不变，设置2、4、6、8、10 h等时间点进行摇菌，而后取样进行蛋白变性，取15 μL样品SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察结果.

最佳诱导浓度和最佳诱导时间不变，设置4、25、37、45 ℃等温度进行摇菌，而后取样进行蛋白变性，取15 μL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察结果.

1.7 重组串联蛋白的Western blot鉴定

将1.6步骤中诱导表达的串联蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，利用转印槽将目的条带转印到醋酸纤维素膜，随后于湿盒中37 ℃孵育一抗(抗His和抗PEDV阳性血清)、二抗，底物显色发光，凝胶成像系统拍照.

2 结果与分析

2.1 S基因的PCR扩增结果

M:DL2000 DNA Marker 1：S基因的扩增产物.图1 S基因的PCR扩增结果Fig.1 The results of S gene by PCR

以S基因的上游(S-F)、下游(S-R)为扩增引物进行PCR扩增，经凝胶电泳分析，可以明显看到1条约为639 bp的特异性条带(如图1)，与预期的结果相符.

2.2 串联重组表达质粒的鉴定

按照1.5步骤操作，结果表明(图2A)，大约在639、844、1 943和2 086 bp处有相应的条带出现，与预期结果相符.酶切鉴定(如图2B)显示连入S基因的串联质粒比只连入M基因的重组质粒的位置要来的高，单酶切后显示的条带位置和预期的一样，分别用BamHⅠ和SalⅠ、HindⅠ和NotⅠ对串联重组的质粒进行双酶切，在697和639 bp的位置上得到目的片段，同时用M基因(BamHⅠ)+S基因(NotⅠ)进行酶切，在1 330 bp的位置上出现了条带，和预期的片段长度相同.鉴定结果表明，PEDV S蛋白已成功克隆至重组质粒Pet-32a-M中.测序结果进一步表明，串联重组质粒(Pet-32a-S-M)成功构建.

2.3 SDS-PAGE分析结果

M:蛋白marker;1:PET-32a诱导组;2:pET-32a-M-S未诱导组;3:pET-32a-M-S诱导组.图3 E.coli BL21(DE3)中重组pET32a-M-S蛋白的诱导表达结果Fig.3 The analysis of protein pET-32a-M-S expression in E.coli BL21 (DE3) by SDS-PAGE

本实验室已构建的pet-32a-M质粒诱导表达的目的蛋白约43.6 ku(包括标签多肽蛋白20 ku)，而S蛋白的预测分子质量约23.4 ku，SDS-PAGE电泳分离结果显示(图3)，pET-32a-M-S串联重组质粒菌在IPTG的诱导下，在(15～25 ku)和(35～45 ku)这两个区间各有1条明显的条带，而空质粒对照组在这两个区间没有出现该特异性条带.将pET-32a-M-S未诱导组(2)和pET-32a-M-S诱导组(3)进行对比可以发现，诱导后S蛋白出现的特异性条带比未诱导组所出现的条带粗，而诱导后M蛋白呈现的条带也比未诱导组所出现的条带粗且亮.

2.4 诱导表达条件的优化结果

在37 ℃条件下，随着IPTG浓度的改变，结果(如图4a)显示，IPTG终浓度为0.6 mmol·L-1诱导条件下，M蛋白条带最粗、最亮(43.6 ku)，S蛋白条带偏亮(23.4 ku)，即在0.6 mmol·L-1下蛋白重组表达量最佳.

A：M:蛋白质分子质量标准；1：空载组诱导组；2～7：分别为IPTG诱导浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol·L-1，梯度下诱导的重组质粒菌组；B：M:蛋白 marker；1：空载诱导组；2～6：分别为诱导后2，4，8，10 h梯度下诱导的重组质粒菌组；C： M：蛋白Marker1：空载诱导组 2-5分别在4、16、25、37 ℃梯度下的诱导组.图4 重组蛋白诱导表达条件SDS-PAGE电泳图Fig.4 Electrophoresis identification of recombinant protein under various expression condition

以终浓度为0.6 mmol·L-1，温度37 ℃不变为前提，随着诱导时间的改变，蛋白表达量不同，(如图4b)可以看出在8h时M蛋白和S蛋白的条带达到最亮最粗，即在此条件下M蛋白和S蛋白表达量最佳.

在IPTG终浓度为0.6 mmol·L-1条件下，诱导8 h不变的条件下，并分别放置于4、16、25、37 ℃温度梯度下进行诱导，诱导结果(如图4c)所示，在25 ℃条件下M蛋白的条带相对于其它温度诱导的蛋白条带亮更粗，而S蛋白诱导的蛋白条带也相对其它温度下的诱导出来的条带更亮.因此，25 ℃为pET-32a-M-S串联质粒的最适诱导温度.

2.5 Western-blot鉴定结果

为验证上述步骤最终得到的蛋白是否为预期的目的蛋白，以His·Tag标签蛋白的抗体作为一抗，对诱导变性后的蛋白进行Western blot分析.结果如图5A所示，串联重组质粒菌组和空质粒菌组分别在约43.6、23.4和20 ku的位置出现了特异性条带，而空载菌组未出现任何条带.同时以PEDV阳性血清的抗体作为一抗，对诱导变性后的蛋白再次进行Western blot分析，结果(如图5B)可见，空载诱导组在35～45 ku和25 ku处均未出现明显的特异性条带，而串联重组质粒组在这两个区间有明显的特异性条带的出现.由此可进一步表明M-S蛋白在体外成功被串联表达.

A:Anti-HIS：1.空载诱导组2:25 ℃；血清：1：空载诱导组2：25 ℃;B:Anti-HIS：1.空载诱导组2:25 ℃；血清：1：空载诱导组2：25 ℃.图5 重组蛋白的免疫印记鉴定电泳图Fig.5 Electrophoresis of recombinant protein identified by Western Blot

3 讨论

(1)自2010年以来，PEDV的流行出现了上升的趋势，即使接种了PRDV二联苗和弱毒苗进行免疫预防，仍无法使猪场避免该病的发生[9]，多个研究表明，随着单个碱基的改变或缺失都会使毒株之间的免疫原性发生改变，而该病毒的S蛋白自身也存在29个潜伏的N-糖基化位点，这也是容易发生变异的关键因素[10].

(2)当S基因发生变异时，其刺激宿主产生中和抗体降低，对识别相应毒株的能力减弱，造成其制备的单个蛋白的疫苗效价降低，而单个M基因的构建[11]，其制备的M蛋白也只能应对单一的情况，一旦有新的疫情发生，都无法使各类的猪获得较好的免疫.由此，提出假设是否能体外同时诱导表达出2个蛋白，本试验将S蛋白和M蛋白进行串联，经一系列的鉴定，成功体外诱导了串联蛋白，串联蛋白作为新型疫苗，其表达的优点是产量大，免疫原性更强，效果是单联蛋白的1倍甚至更多，与单联蛋白的区别在于，单联蛋白在变异株间免疫作用局限小，甚至完全失效，而串联蛋白由2段基因的蛋白构成，变异株间的免疫作用相对较大，即使S基因有部分发生改变，仍能在控制范围内.

(3)今后，将重点对串联蛋白的纯化以及诱导机体中和抗体产生的功能进行研究.