海南石解与昌江石解体外抗菌活性实验研究

杨柳 滕李濛 黄内力 景浩瑞 黄秋芳 鲍勇财 王美轩 余邦良 杨文

摘要 为探索海南石解（Dendrobium hainanense）和昌江石解（Dendrobium changjiangense）不同提取部位的体外抗菌效果，以金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、白色念珠菌为受试菌株，采用倍比稀释法、琼脂平板法对海南石解和昌江石解不同部位进行抗菌活性筛选，并考察对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的生长抑制曲线和电导率变化情况。结果表明，A、E能显著抑制金黄色葡萄球菌的正常生长，A对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）为2.5mg/mL，最低杀菌浓度（MBC）为5.0mg/mL;E对金黄色葡萄球菌MIC和MBC均为2.5mg/mL;且E极显著增加金黄色葡萄球菌的渗透性。A、C、E显著抑制白色念珠菌的正常生长，F极显著抑制白色念珠菌的正常生长，增加白色念珠菌的渗透性，F对白色念珠菌的MIC和MBC均为1.25mg/mL。表明海南石解的乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌有较强抗菌效果，昌江石解的乙酸乙酯部位对白色念珠菌具有较强抗菌效果，该结论为海南石解和昌江石解进一步开发奠定了科学基础。

关键词 海南石解;昌江石解;提取物;抗菌活性

中图分类号 S567.239 文献标识码 A

石解作为中国传统药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效。现代医学研究表明：石斛化学成分较为复杂，主含有糖类、生物碱、菲类、香豆素、氨基酸等，具抗氧化、抗炎、降血糖、调血脂、抗菌等功效[1-4]，不同产地、品种、栽培时间的石解，其化学成分不同，药效也不尽相同[5-6]。何劲等[7]从贵州产的金钗石解和流苏石解中分离到4株具有强烈拮抗真菌的内生细菌，结果表明，该菌对19株丝状真菌有抑制作用。张周英等[8]从广东产的铁皮石解和金钗石解中提取多糖，结果发现，从这两种石解中提取的多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎球菌均有明显的抑菌作用。

海南石解（Dendrobium hainanense）和昌江石解（Dendrobium changjiangense）主要分布于海南三亚、陵水、琼中、昌江、白沙、定安等地区[9]，为海南特有石解属物种[10]。有文献报道，石解属植物具有一定抗菌活性[1l-12]。目前，有关海南石解和昌江石解的研究报道较少。如张友源[13]等对海南石解化学成分进行研究，尚未发现海南石解和昌江石解抗菌药理活性报道。因此，为进一步开发利用海南这2种天然石解资源，本文采用4种菌株，通过监测抑制菌体生长曲线，探究菌体电导率的变化和菌体细胞膜的渗透性影响，初步探讨抗菌机制，以期为海南石解和昌江石解作为天然植物类抗菌药物开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

2016年9月采自海南省昌江县霸王岭，经鉴定，为兰科石解属海南石解（D.hainanense）和昌江石解（D.changjiangense），现存放于海南医学院化学实验教学中心，编号分别为HNSH-201609、CJSH-201609。

1.1.2 菌株

金黄色葡萄球菌（S.aureas ATCC 25923）、白色念珠菌（C.albicans ATCC 10231）、大肠杆菌（E.coliATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（K pneumoniae ATCC13883）均购自广东省菌种保藏中心。

1.1.3 试剂

沙保罗氏琼脂、沙保罗液体增菌培养基（杭州滨和微生物试剂有限公司）; MH肉汤培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）;MH琼脂培养基（广东环凯生物科技有限公司）;DMSO（阿拉丁试剂有限公司）;酯酸氯己定（成都第一制药原料药有限公司）;万古霉素（浙江海正药业股份有限公司）;吐溫80、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均为分析纯，购于西陇化工股份有限公司）。

1.1.4 仪器

RE-52CS-2型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;DZF-6050型真空减压干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）;SPX-150B-2Z型生化培养箱（上海博远实业有限公司医疗设备厂）;LDZX-40BI型高压消毒锅（上海申安医疗器械厂）;THZ-1038型恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司）;UV1800PC型紫外可见分光（海凤凰光学科仪有限公司）;SP-DJ系列净化工作台（上海浦东物理光学仪器厂）;DDS-12A型电导率仪（上海虹益仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同提取物的制备

参照张友源等[13]方法，制得海南石斛乙醇部位（A） 163.5g、昌江石解乙醇部位（B）147.8g、海南石解石油醚部位（C）24.4g、昌江石解石油醚部位（D）20.8g、海南石斛乙酸乙酯部位（E）22.6g、昌江石解乙酸乙酯部位（F）12.4g、海南石斛正丁醇部位（G）17.3g、昌江石斛正丁醇部位（H）16.9g。

1.2.2 实验分组及样品溶液的制备

称取A、B、C、D、E、F、G、H各400mg、分别加入10mL、10%DMSO水溶液，滴入10滴吐温80，超声溶解至溶液澄清，配制成待测样品溶液，以不加样品作为对照。称取400mg的万古霉素（酯酸氯己定），用相同溶剂溶解，作为检测细菌（真菌）的阳性药物。其他分组如表1、表2所示。

1.2.3 实验菌液的配制

参照中国药典方法[14]，分别配制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌菌液，稀释至浓度均为1×10⁶CFU/mL。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）测定

采用倍比稀释法[15]，取1～7号试管，分别加入体积相同已配好的MH肉汤液体培养基（细菌培养）或沙氏液体培养基（真菌培养），将待测样品溶液或阳性药物从1号管依次倍比稀释至7号管，使待测样品浓度分别为20.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.312mg/mL。8号试管加入3mL 10%DMSO水溶液（3滴吐温80）;9号试管加入3mL培养基溶液;用移液器吸取100μL细菌（1×10⁶CFU/mL）依次加入1～9号试管内，10号试管不加受试菌，加入3mL不同部位提取物和3mL培养基溶液;11号试管不加受试菌，加入3mL不同部位提取物溶液。摇匀，置于37℃恒温箱内，细菌考察培养24h后观察结果，真菌考察培养48h后观察结果。在对照管符合要求的情况下[15]，凡无肉眼可见细菌生长的不同部位提取物最低浓度即为待测药物对该测试菌的MIC。

1.2.5 最低杀菌浓度（MBC）测定

分别从观察MIC试管中移取O.1mL溶液于相应培养基琼脂平板上作次代培养，置于37℃恒温箱内，细菌考察培养24h后观察结果，真菌考察培养48h后观察结果，观察有无菌落生长。以无菌落生长的药物浓度作为该受试菌的MBC[15]。

1.2.6 细菌生长抑制曲线的影响

取有抑菌、杀菌效果的不同部位与相应作用的菌株，考察该菌在药物作用下对菌体生长抑制情况。根据1.2.5结果进行分组：待测药物组、不加菌的培养基为参比组，不加药物只加菌和培养基为阳性对照组（菌液浓度为1×10⁶CFU·mL^-1）。以1倍MIC和2倍MIC药物浓度值为考察点，以上各实验组均加入相应的培养基（肉汤培养基或沙氏培养基），置于37℃、120r/min培养，每隔2h取样，细菌培养24h，真菌培养48h于波长600nm处测定吸光度。以取样时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线[16-17]。

1.2.7 对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌细胞膜渗透性的影响

根据1.2.5、1.2.6实验结果，参照前人方法[18]，分别将浓度为1MIC、2MIC的药物、40mg/mL万古霉素（酯酸氯已定）加入带菌悬液的培养基中，阳性对照组为菌体培养基，置于37℃恒温培养，分别于0、2、4、6、8、10、12h取样，测量电导率，实验重复3次，取平均值。以取样时间为横坐标，电导率为纵坐标绘制曲线，观察各个部位对菌体细胞膜渗透的影响。

1.3 数据统计分析

采用单因素t检验方法，SPSS19.0软件对所有数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 药物最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC）测定

由于受试药物为有色非透明物质，需要平板划线观察MIC。以小于5个菌落，且菌落数明显少于阳性对照组所对应试管最大稀释度的药物浓度为MIC[19-20]。由表1～3可知，对于金黄色葡萄球菌：A，E抑菌和杀菌效果比较好，A的MIQV2.5mg/mL、MBC为5mg/mL，E的MIC和MBC均为2.5mg/mL;F、G的抑菌和杀菌效果较差，F的MIC为10mg/mL、MBC为20mg/mL，G的MIC、MBC均为20mg/mL;A、E、F、G的抑菌、杀菌效果呈现量效关系，其他部位对金黄色葡萄球菌没有明显的抑菌、杀菌效果。对于白色念珠菌：C、E、F均有较强的抑菌、杀菌效果，其MIC分别为2.5、5、1.25mg/mL，MBC分别为2.5、5、1.25mg/mL;其中F在1.25～5mg/mL具有较强的的抑菌、杀菌效果，但浓度达10、20mg/mL后抑菌、杀菌效果较差，这种在一定浓度范围具有杀菌的作用与75%乙醇性质相似，并没有明显呈现药物作用的量效关系;A、C、E与阳性对照相比，差异显著;F与阳性对照相比，差异极显著。2种石解的8个不同部位对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均没有任何抗菌的效果。

2.2 细菌生长抑制曲线的影响

选择A、E、F、G考察对金黄色葡萄球菌生长抑制情况，选择A、B、C、E、F考察对白色念珠菌生长抑制情况。由图1可知，金黄色葡萄球菌的阳性对照组在8h之前细菌繁殖较慢，为细菌生长的迟缓期，随后生长繁殖速度加快，进入对数生长期;A、E、F、G高浓度和低浓度溶液处理后的金黄色葡萄球菌生长均受到一定的抑制，且随着药物浓度的增加，对细菌生长的抑制作用增强，说明具有一定量效关系。其中A、E与阳性对照间差异显著，能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。

由图2、3可知，白色念珠菌阳性对照组16h之前生长繁殖较慢，随后速度增加，进入对数生长期，30 h后进入稳定期，其吸光值为1.998。A、B、C、E、F高浓度和低浓度处理后的白色念珠菌生长均受到一定的抑制，吸光值增长速度较慢，在菌体对数生长期吸光值增长速度显著小于阳性对照，说明菌体繁殖速度远远低于阳性对照组。A、C、E与阳性对照间差异显著;F与阳性对照间差异极显著。药物浓度越高，抑制菌体生长越明显。药物作用后的菌体在整个生长期内，吸光度先上升后下降，这也许是由于药物使细菌自身发生了应激反应，使菌体在一定时间内决速生长，随后菌体生长被抑制，出现曲线下降趋势，说明A、C、E、F对菌体生长具有较好的抑制作用，这与周本宏[21]结论相似。

由此可见，A、E对金黄色葡萄球菌具有较好抑菌效果，F对金黄色葡萄球菌具有一定抑菌效果，C、E、F对白色念珠菌具有较好抑菌效果。

2.3 对菌体细胞膜渗透性的影响

选择A、E、F考察金黄色葡萄球菌对电导率的影响，选择C、E、F考察白色念珠菌对电导率的影响。由图4可知，对于金黄色葡萄球菌：与阳性对照相比，E的两个浓度电导率增加较快，差异极显著;与万古霉素比较，E的两个浓度电导率差异不显著，说明其对菌体细胞膜的渗透性相似（P>0.05）。对于白色念珠菌：与阳性对照相比，F和高浓度E电导率增加较快，差异不显著;与酯酸氯己定比较，F的低浓度电导率差异不显著，说明其对菌体细胞膜的渗透性相似（P>0.05）。

3 讨论与结论

张在强等[2]发现，迭鞘石解醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌和杀菌作用较好;王琳等[11]发现，齿瓣石解提取物对金黄色葡萄球菌抗菌效果较好。本研究通过4种菌株对海南石解和昌江石解不同提取部位抗菌活性进行筛选，采用倍比稀释法和琼脂平板法对8个不同部位进行抗菌实验，测定各个部位的MIC和MBC值。结果表明，对金黄色葡萄球菌：A、E抑菌、杀菌效果比较好，F、G抑菌作用较弱，B、C、D沒有抑菌、杀菌作用;对白色念珠菌：A、C、E、F均有较强的抑菌、杀菌效果，B有一定抑菌、杀菌效果，D、G、H没有抑菌、杀菌效果。该方法是目前体外抗菌活性筛选的常用方法，可行性较高。其研究结果与前人结论相似，海南石解和昌江石解对金黄色葡萄球菌抗菌的MIC值均比前人报道的石解属其他石解的MIC值低[2，11-12]，但这2种石解的不同提取部位对白色念珠菌的抗菌效果较好，这值得进一步研究。

采用具有抗菌活性部位的MIC、2MIC两个不同浓度，考察对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌体正常生长抑制性及对菌体细胞膜渗透性。结果表明，E能有效抑制金黄色葡萄球菌正常生长，提高菌体细胞膜的渗透性，与万古霉素抗细菌实验结果相似，具有很好抗菌效果，该结论与尹永洁[22]研究结果相似;E对金黄色葡萄球菌抗菌效果较好，这与张薇薇等[12]叠鞘石解水提取部位对金黄色葡萄球菌具有较好的抗菌活性的研究结果不同。F能有效抑制白色念珠菌正常生长，且能够提高菌体细胞膜的渗透性，与酯酸氯已定抗细菌实验结果相似（P>0.05），具有较好抗真菌效果，这与吴晶[23]结论相似。

综上所述，海南石解的乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌有较强抗菌效果，昌江石解的乙酸乙酯部位对白色念珠菌具有较强抗菌效果。本研究初步探究了石解体外抗菌的机制，为以后开发抗菌药物奠定前期基础。

参考文献

[1]宋广青，刘新民，王琼，等.石解药理作用研究进展[J].中草药，2014，45（17）：2576-2579.

[2]张在强，陈泓羽，冯煜，等.迭鞘石解提取物对四种致病菌的抑制作用[J].食品与发酵科技，2016，52（3）：26-27.

[3]王玲，唐德强，王佳佳，等.铁皮石解原球茎与野生铁皮石解多糖的抗菌及体外抗氧化活性比较[J].西北农林科技大学学报，2016，44（6）：168-172.

[4]李娟，李顺祥，黄丹，等.铁皮石解资源、化学成分及药理作用研究进展[J].科技導报，2011，29（18）：74-79.

[5]Xu J，Han Q B，Li S L，et al.Chemistry，bioactivity andquality control of Dendrobium，a commonly used tonic herbin traditional Chinese medicine[J].Phytochem，2013（12）：341-367.

[6]Chen X M，Wang F F，Wang Y Q，et al.Discriminationof the rare medicinal plant Dendrobium ofcinale based onnaringenin，bibenzyl，and olysaccharides[J].SCIENCECHINA Life Sciences，2012，55（12）：1092-1099.

[7]何劲，雷帮星，康冀川，等.石解抗真菌内生细菌的筛选及其抗菌特性的初步研究[J].西南大学学报（自然科学版），2009，31（16）：92-96.

[8]张周英，杨成密，蓝忠，等.石解多糖的抗菌作用研究[J].中国医药指南，2012，10（33）：439-440.

[9]陈焕镛.海南植物志（第4卷）[M].北京：科学出版社，1964：221-223.

[10]中国植物志编辑委员会.中国植物志（第19卷）[M].北京：科学出版社，1999：143.

[11]王琳，王涛，杨敏，等.齿瓣石解提取物体外抗菌作用初步研究[J].安徽农业科学，2012，40（17）：9338-9339.

[12]张薇薇，邓晓东，张在强，等.叠鞘石解水提取物对小肠结肠炎耶尔森菌的抗菌活性及机制研究[J].现代预防医学，2016，43（10）：1852-1854.

[13]张友源，宋希强，梅文莉，等.海南石解化学成分研究[J].热带亚热带植物学报，2015，23（3）：317-322.

[14]国家药典委员会.中国药典：2015年版第四部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：1105.

[15]韩文瑜，何昭阳，刘玉斌.病原细菌检验技术[ml.长春：吉林利学技术出版社，1992：77-78.

[16]朱旭芬.现代微生物学实验技术[M].杭州：浙江大学出版社，2011：125-127.

[17]王倩木.犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其作用机制[D].沈阳：辽宁师范大学，2011：11-12.

[18]李冬冬.杏香兔耳风抗菌活性成分作用机制研究[D].郑州：河南大学，2015：36-45.

[19]池水晶，宝珠鸣，王艳红，等.紫茎泽兰提取物的体外抗菌活性研究[J].广东农业科学，2015（1 s）：73-74.

[20] Nitin P K，Vikas J，Vijay K K，et al.Chemical compositionand ntibacterial activity of essential oils of Lantanacamara，Ageratum Hous to nianum and Eupatoriumadenophorum [J].PharmaceuticalBiology，2010，48（5）：539-544.

[21]周本宏，松长青，姜姗，等.地榆鞣质提取物的抗菌活性及对金黄色葡萄球菌的抑菌机制研究[J].中国药师，2016，19（3）：464-469.

[22]尹永洁.朝药泽泻提取物及其化学成分的抗菌活性研究[D].延吉：延边大学，2017：10-29.

[23]吴晶.中药抗真菌的活性筛选及作用机制研究[D].上海：第二军医大学，2017：74-77.