郭天奇 李雪 综述 周延民 赵静辉 审校
口腔材料直接与牙周组织和黏膜上皮相接触,广泛应用于口腔种植修复、牙体牙髓治疗等领域中,其生物安全性尤其是潜在的致癌可能性尤为重要。
遗传毒性试验是指通过不同检测手段检测受试物直接或间接诱导的细胞内遗传物质损伤的体外和体内试验[1]。近年来,对于遗传毒性的评价方法在不断改进和完善。据报道,目前已建立的遗传毒性短期检测法已超过200种。我国曾在GB/T16886.3—2008标准中规定:体外法评价遗传毒性实验应组合选用细菌回复突变试验(OECD471)、体外哺乳动物细胞基因突变试验(OECD476)和染色体畸变实验(OECD473),或者单纯应用前两者,体外法评价遗传毒性实验可以联合选用微核试验(OECD474)及啮齿动物中期骨髓分析(OECD475)。随着实验手段的进展及新方法的出现,其他多种具有不同优点的遗传毒性试验也逐渐被国内外学者发现并认可。现今在评价口腔材料生物安全性的过程中,国内外学者最常见应用的几种实验主要为:彗星实验,微核试验,染色体畸变实验,H2AX探针测量DNA双键断裂,测量反应性氧的浓度以及细菌回复突变试验等[2-3]。本文就这几种常见的实验进行论述和总结,并对它们相对的优缺点进行评价。
单细胞凝胶电泳实验(SCGE)是一种在单个细胞水平上检测真核细胞DNA损伤的一种灵敏且简单的技术,这门技术由Ostling等在1984年首次提出,Singh等[4]将其改进。其原理:高盐裂解溶液破坏细胞膜,将细胞内胞质游离,而相对分子质量较大的染色质则留在原位,通电电泳使得受损伤的DNA片段在电场作用下游离出来,而未受损伤的DNA分子则继续留在原位。经溴乙啶染色后,染色质在紫外线照射下发出荧光,受损的细胞呈现“彗星”外观,明亮的头部为“彗核”,受损的DNA断片脱离彗核组成“彗尾”,故这种检测方法也被称为comet assay(彗星实验)。细胞DNA断片越多、相对分子质量越小,形成的“彗尾”越长。该实验测定细胞DNA受损的程度,一般有3 个指标:彗尾的长度、强度及尾矩。通常用碱性裂解液(pH>13)处理细胞,不仅可以使细胞内蛋白成分分离更加彻底,也有利于DNA双螺旋破坏和单链片段移行,Collins等[5]指出SCGE对于DNA超螺旋的解旋情况。
外周血直接提取的淋巴细胞提取方法简易,成本低廉,提取分离后可以即刻进行试验,故常见于评价口腔生物材料安全性的SCGE实验中:Droidz等[6]提取人血液分离出的淋巴细胞用碱性和中性SCGE法发现0.15 mmol/L的Bis-GMA即可以使得DNA双键断裂,并且会阻碍淋巴细胞本身的DNA修复过程。Poplawski等[7]应用人血淋巴细胞行SCGE,发现:2.5 μmol/L的GMA就可以阻碍90%以上淋巴细胞的DNA修复过程。Kaya等[8]也提取成人外周血液内的淋巴细胞,通过SCGE电泳结果的尾长、尾强、尾矩3 个指标评价了不同粘接剂的遗传毒性。Brzovic等[9]选用外周血淋巴细胞评价了6 种不同品牌的根管充填剂的致畸变毒性。Baraba等[10]同样选用外周血淋巴细胞通过评价了彗尾的长度及强度,证实了2 种树脂基的根管充填材料具有较好的遗传安全性。
SCGE对细胞并没有特殊要求,理论上只要是真核细胞就可以进行SCGE实验。Tavares等[11]将CHO-K1(小鼠卵巢细胞)附着在纯钛以及等离子体处理的钛片上培养24 h后,通过comet assay证实等离子体处理组的尾矩有显著降低,提示对于grade=2的纯钛,等离子体表面处理可以提高钛片的生物相容性。Volk等[12]选用健康成人的牙龈细胞评价了不同浓度樟脑醌的遗传毒性。Pligina等[13]选用Hela细胞系评价了5 种不同根管冲洗液的致畸变毒性。Marins等[14]选用小鼠成纤维细胞3T3-L1证实了较低浓度的次氯酸钠(2.5%)以及较高浓度的柠檬酸(21%)即具有相对较强的致畸变毒性。
在评价口腔材料的遗传毒性方面,SCGE法简便易行、实验周期较短、重复性好、灵敏度高,可以测出每1.657×10-18kgDNA中1 个碱基对的断裂,可选用的受试细胞范围广泛,理论上讲,SCGE法可以适用于任何真核细胞,甚至适用于分离出来的染色体[15]。
H2AFX,是H2A组蛋白家族的成员之一,由组蛋白H2A基因编码,在真核生物的细胞中,DNA缠绕在各种组蛋白上包含H2A,H2B,H3等成分[16],因此,H2AX是核小体以及DNA结构的基本组成部分[17]。经过丝氨酸-139磷酸化后,H2AX转换为γ-H2AX foci,同时也是DNA双链断裂诱导产生的反应产物[18],PI-3家族的激酶DNA-PK,ATM和ATR激酶均参与了磷酸化的反应,从而参与DNA双链断裂(DSBs)的修复[19],因为一旦DNA的排列变得更加稀疏,会有更多的空间供DNA修复蛋白就位,也证明了γ-H2AX foci有较强的DNA修复能力[20]。电离辐射可以导致DSBs的出现,并产生γ-H2AX foci,将γ-H2AX foci与特定的系列荧光性抗体结合,可以通过测量荧光度的方法定量计算DSBs的出现[21]。
Shehata等[22]表示:DNA修复过程不能完全抵消已经造成的DNA损伤,因此γ-H2AX foci虽然在细胞内起到修复DNA双键断裂的作用,同时也成为检测细胞内DNA双键断裂的一个敏锐的指标。γ-H2AX无论在体内还是体外实验中,都具有灵敏的检测早期微量DSBs的作用。环境中仅仅1 mGy的电离辐射即可影响细胞内γ-H2AX的水平,其灵敏度达到了传统染色体畸变实验的100 倍[23]。Cogan等[24]通过测量γ-H2AX的表达从而证实了四价铬离子对成纤维细胞的遗传毒性。Durner发现[25]与0.25 mmol/L浓度的BisGMA接触24 h后,细胞受损产生的Gamma-H2AX foci含量相当于接受了4 Gy的射线照射的量。
微核(micronucleus,MCN),是分裂间期细胞中染色体畸变的一种表现形式。19 世纪末,Howell和Jolly两位学者分别在人外周血网织红细胞内发现Feulgen染色阳性的微小的细胞核样物质,并将其命名为Howell-Jolly小体,这一小体便是微核(MCN)[26]。微核实验主要以观测有丝分裂期间未能达到纺锤体极的染色体片段或者整条染色体为目标[27]。
镜下筛选微核的标准如下:微核直径不大于主核的1/3。颜色必须与主核一致或者略深于主核,必须位于细胞质内。2001年Fenech等[28]将这一标准修改为:微核直径需在主核的1/3到1/16之间。然而计数为微核的标准并不绝对,Tavares等[11]在实验中,将分裂末期双细胞核之间的染色质桥以及主核上未完全分离的小球样染色质结构也记做微核。微核试验,同SCGE一样,都是在单个细胞水平上进行评价。一般统计500~1 000 个细胞,每个细胞都作为一个样本,也保证了实验充足的样本量。
微核试验既可以做体内实验,也可以做体外实验。许多学者甚至直接刮取患者的口腔黏膜细胞进行微核试验。Natarajan等[29]发现镍铬正畸托槽会显著升高颊粘膜细胞的微核频率。Klaric等[30]计数了应用牙齿漂白剂的患者的微核形成总量。Azhar等[31]选取常年与MMA单体接触的14 名口腔医生的颊黏膜细胞并作微核试验探究MMA单体的致畸变毒性。
动物微核试验的体内方法主要以小鼠为受试物,给药方式可以尾静脉注射[32],可以口服,也可以是腹腔注射。微核试验的体外细胞实验研究可以选用的受试细胞广泛,但大多以淋巴细胞和成纤维细胞为主。Fernandez等[33]选用小鼠3T3/NIH成纤维细胞证实了过碳酸钠以及过硼酸钠对成纤维细胞具有致畸变毒性。Camárgo等[34]选用中国仓鼠V79成纤维细胞比较了不同根管充填剂的遗传毒性。Demirci等[35]同样选用V79成纤维细胞进行微核试验来测量7 种不同品牌的粘接剂的遗传毒性 。Laurent等[36]直接提取人血液中淋巴细胞,发现各个浓度的Ca3SiO5提取液与阴性对照组的微核形成率并无显著差异,从而证实Ca3SiO5并无明显致畸变毒性。
微核试验不仅可以侦测染色体组的损伤,同时可以侦测出染色体丢失以及有丝分裂中期纺锤体的异常[37],所以在甄别口腔生物材料是否具有致畸变特性中,很多学者都选用微核试验或者联合微核试验与其他实验共同应用。
染色体畸变指染色体数目的增减或结构的改变,镜下观察染色体畸变一般有如下几种表现:染色体沟,染色体断裂,染色单体交换[38],双着丝粒染色体,环状染色体以及染色体碎片。也有学者将染色单体沟和染色单体断裂作为计数标准[39]。
染色体畸变实验对细胞没有明确限制,原则上只要是真核细胞就可以,在评价口腔生物材料的致畸变毒性时,学者们曾选用MRC-5细胞、牙髓细胞[40]、外周血淋巴细胞[41-42]等。一般每组计数100 个细胞,常规Giemsa染色后即可进行镜下观察。
Tavares等[11]发现等离子体处理会使得钛片更具有抗腐蚀性从而析出较少的钛粒子,该结论也与作者进行的SCGE实验结论一致。染色体畸变实验方法简单易行,观测手段直接,然而灵敏度并不高,所以该方法多与SCGE以及微核试验联合应用。
活性氧类(ROS)指细胞内含有氧自由基的化学活性物质,细胞正常代谢产生的ROS对于细胞内信号传导以及维持细胞稳态有着重要作用。细胞接收到外界环境不适宜刺激(如过多的紫外线)后,ROS的含量则会迅速上升,导致细胞结构的破坏,这种应激反应称之为氧化应激[43]。
ROS对于细胞的损伤体现在以下几方面:DNA原始损伤,脂质的过氧化,氨基酸的过氧化变性,激活体内无活性的特定酶[44]。ROS导致的DNA氧化是基因突变的主要原因,诱变结果主要包括生成8-羟基鸟嘌呤,DNA单链断裂,加合蛋白质和DNA使得DNA链内交联或链间交联等[45]。最常见的突变是生成8-羟基鸟嘌呤,后者在DNA的复制过程中,错误的与腺嘌呤配对,并最终导致G变为T的转换突变。
过量的ROS会通过多种通路促进细胞的凋亡[46],Fas配体产生ROS的同时会促进Fas配体本身的磷酸化,从而产生Caspase8,促进细胞的凋亡。另一种通路是ROS通过激活细胞核稳定蛋白质Bcl-2的表达以促进细胞色素C的释放[47]。
在评价口腔生物材料方面,通常选取牙髓细胞[48]以及牙龈成纤维细胞[49]进行ROS的测量。而ROS的检测方法一般都应用无荧光的DCF,其在体内会被激酶转化为DCFH,后者可以被细胞质中的ROS氧化变为发荧光的DCF-DA[50],发出波长为Ex/Em=485/528 nm的荧光,通常通过光度计可以定量DCF-DA从而反映出细胞质内ROS的量[51]。
鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变实验又称Ames试验,组氨酸缺陷型测试菌株,不能在缺乏组氨酸的培养基中大量生长,只能形成几个微小的菌落,将菌株与被检化合物接触后,如果该化合物具有致突变性,则化合物可使该菌株发生回复突变,重新成为野生型菌株[52],发生回复突变后,菌株可大量在缺乏组氨酸的培养基上生长并形成肉眼可见的菌落。Ames试验主要检测DNA的碱基置换和移码突变,具有不错的的敏感性、特异性和准确性[53]。常用的4 种菌株中,TA97、TA98可检测移码突变,TA100可检测碱基置换,而TA102可同时检测移码突变和碱基置换。Chen等[54]通过Ames实验证实凝胶处理的硅表面涂层材料不具有致畸变毒性。Ames实验更多与其他实验如SCGE,微核试验[55]联合应用,对评价口腔生物材料的致畸变毒性起到相辅相成的作用。
评价口腔材料的遗传毒性试验多种多样,各实验的针对畸变位点也不尽相同[55],在遗传毒性检测中,学者们极少单一应用某种试验的结果得出受试物的致畸变特点,而多是联合应用多种方法,使其结果相互验证,方法优势互补,以保证实验的灵敏度及提高可信度。不同实验的联合应用,通过各实验阳性结果的差异分析可以得知受试物的具体致癌性机制。