一株蛋白核小球藻对猪场沼液的净化研究

田晨雪　刘明　黄开耀

摘要：为了更经济、有效地处理猪场沼液，采用微藻净化沼液的方法，通过一株蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）对10%猪场沼液稀释液为期18 d的净化，全面检测沼液在净化过程中不同时期、不同指标的变化情况。结果表明，蛋白核小球藻可在消毒后的沼液稀释液中存活且具有较好生长状态，OD680 nm最高可达1.206、相对生长速率最高可达0.208 0。经过蛋白核小球藻净化后，沼液中总氮、总磷、铵态氮含量去除率分别为61.89%、99.72%、96.79%；硝态氮以及亚硝态氮含量有所上升；COD含量变化曲线呈波动情况。证明了蛋白核小球藻净化猪场沼液的可行性。

关键词：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）；沼液；总氮；总磷；铵态氮

中图分类号：X703 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）18-0039-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.009 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Purification of A Biogas Slurry of Chlorella pyrenoidosa

TIAN Chen-xue1，LIU Ming2，HUANG Kai-yao3，JIANG Si-wen1，4，GAO Qi-shuang2，MIAO Wen5

（1.College of Animal Science and Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Wuhan Academy of Agricultural Sciences and Technology，Wuhan 430208，China；3.Key Laboratory of Algae Biology， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072，China；4.Hubei Pig Health Aquaculture Collaborative Innovation Center，Wuhan 430070， China；5.Wuhan COFCO Meat Products Co. Ltd.，Wuhan 430070，China）

Abstract： In order to treat biogas slurry more economically and effectively， microalgae was used to purify biogas slurry. The aim was to fully detect the changes of biogas slurry at different times and different indexes during purifying 10% diluted biogas slurry by a Chlorella pyrenoidosa for 18 days. The results showed that the algae chlorella pyrenoidosa could survive in the biogas slurry after disinfection and had a good growth status whose highest OD680 nm could reach 1.206，highest relative growth rate could reach 0.208 0. The removal rates of total nitrogen，total phosphorus and ammonium nitrogen in biogas slurry were 61.89%，99.72% and 96.79%，respectively； The contents of NO3--N and NO2--N increased a little； And COD content showed a fluctuation curve. The feasibility of purifying the biogas slurry by C. pyrenoidosa was proved.

Key words： Chlorella pyrenoidosa； biogas slurry； total nitrogen； total phosphorus； ammonium nitrogen

隨着中国经济、社会的发展，集约化养殖的广泛实施带来了严重的环境污染[1]。有报道指出，畜牧业是面源污染的绝对主体[2]。2014年畜禽废水产生量约为30亿t，所含COD、P、N总量分别达1 268.26万、16.04万、102.48万t[3]，其中大部分来源于生猪养殖产业。目前对养猪废水的主要处理方式是“种养结合”，但实际90%以上的养猪企业没有足够的种植基地，造成大量养猪废水无法彻底消纳，蕴含着极其严重的污染隐患。

为了更经济有效地处理养殖废水，20世纪50年代，人们开始探索微藻净化技术，并取得长足进展。马红芳等[4]的研究中月牙藻对总氮的去除率为72.5%；陈香元[5]利用小球藻处理养猪沼液铵态氮、总氮、总磷去除率分别为88.27%、85.04%、41.56%；程海翔[6]研究表明，利用栅藻处理养猪粪水铵态氮、总氮和总磷的去除率分别为97.3%、87.9%和93.2%。中国台湾地区已普遍利用藻类净化猪场沼液。微藻可以利用废水中的氮、磷等元素[7]，也是开发前景良好的原材料[8]。该技术符合中国养猪废弃物资源化利用国策，值得大力研究与推广。

由于蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）处理猪场沼液的研究较少，本试验在猪场沼液中培养蛋白核小球藻，并在此过程中持续监测多项水质指标及其生长状态，为工厂化生产应用该藻种净化养猪废水提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验藻种 蛋白核小球藻来自于武汉净宇微藻科技有限公司。

1.1.2 试验沼液 猪场沼液取自湖北省武汉市中粮肉食有限公司大冶养猪场。沼液预处理：四层300目纱布过滤，去除固体悬浮物。将沼液用自来水配制为10%沼液稀释液。按照0.015 g/L的用量在沼液稀释液中加入强氯精充分溶解混匀进行消毒18 h；加入硫代硫酸钠充分溶解混匀中和曝气1 h，备用。将消毒好的废水分别分装于5 L血清瓶中（图1）。

1.2 主要仪器

UV754N系列紫外可见分光光度计，ACO系列电磁式空气泵，AUY120分析天平，YXQ-LS-50S-Ⅱ立式压力蒸气灭菌器，PHSJ-3F pH计等。

1.3 方法

1.3.1 藻种培养 用蛋白核小球藻先在BG11培养基（表1）中扩培，至蛋白核小球藻在680 nm处的光密度值（OD680 nm）为0.900左右时，将蛋白核小球藻接种至猪场沼液进行持续筛选，直至蛋白核小球藻可在沼液中生长值达到OD680 nm为0.900左右。

1.3.2 藻种接种 当蛋白核小球藻在沼液中生长值达到OD680 nm为0.900左右时，8 000 r/min离心5 min后收集藻细胞。将藻细胞接种于提前消毒好的沼液稀释液中，接种比例为1∶10。

1.3.3 培养条件 将接种好的微藻置于温度（27±1） ℃中，光照度为2 000 lx，光暗比为14∶10，24 h连续曝气。试验周期为18 d。每3 d测定1次藻细胞生长状况，取样同时测定OD680 nm、pH，所有样品采集结束后测定沼液的水质指标。

1.3.4 微藻生长测定及分析 已有研究表明培养液中微藻的细胞密度与其在680 nm处光密度值呈线性相关[9]，因此用紫外可见分光光度计（UV754N，上海仪电分析仪器有限公司）测定活体藻液在680 nm处的光密度值代表细胞密度，根据公式（1）计算微藻接种到沼液后1～18 d的相对生长速率：

K=（lnN2-lnN1）/（t2-t1） （1）

其中，K为相对生长速率；t1、t2为对应的培养时间；N1、N2分别为t1、t2时期藻液的OD680 nm。

1.3.5 沼液水质测定及分析 每隔3 d所取样品用于水质指标总氮（TN）、总磷（TP）、化学需氧量（COD）、氨态氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3--N）以及亚硝态氮（NO2--N）的测定，测定均采用国家环境保护总局颁布的标准方法[10]。总氮用GB11894-89碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，总磷用GB11893-89钼酸铵分光光度法，化学需氧量用GB11914-89重铬酸钾法，氨态氮用GB7479-87纳氏试剂比色法，硝態氮用HZ-HJ-SZ-0138紫外分光光度法，亚硝态氮用GB7493-87分光光度法。各水质指标去除率（r）根据公式（2）计算：

r=（C0-Ct）/C0×100% （2）

其中，C0为初始总氮、总磷等浓度，Ct为培养t天后的浓度（mg/L）。

1.4 统计分析

试验数据均重复3次。试验计算及作图由Graphpad Prism 5完成。

2 结果与分析

2.1 蛋白核小球藻在沼液中的生长特性及pH的变化情况

每3 d测定1次蛋白核小球藻吸光度OD680 nm，结果如图2所示。蛋白核小球藻在10%沼液稀释液中长势良好，OD680 nm快速上升直至15 d时生长减缓进入平台期。OD680 nm最高可达1.206。

测定沼液pH，变化情况见图3。由图3可知，随着蛋白核小球藻对沼液的净化，pH呈先下降后上升的趋势，即酸性先增强后减弱，最终接近中性；而空白对照的pH呈先略微上升后下降至基本平稳，总体变化程度较小。

2.2 蛋白核小球藻在沼液中的相对生长速率

蛋白核小球藻在沼液中的相对生长速率变化曲线如图4所示。蛋白核小球藻3、6、9、12、15、18 d的相对生长速率依次为0.160 6、0.208 0、0.142 1、0.103 6、0.098 9、0.015 0。结果显示，蛋白核小球藻在6 d时达到最高（0.208 0）；18 d时减缓至最低（0.015 0）；相对生长速率整体呈先上升后下降的趋势。

2.3 蛋白核小球藻对沼液中总氮含量的影响

总氮含量变化曲线如图5所示，可以发现蛋白核小球藻对沼液中总氮含量的去除效果较好，去除率最高可达61.89%。总氮含量在前3 d的下降最迅速，在3～15 d下降较为缓慢，甚至在18 d时总氮含量有所上升。蛋白核小球藻对沼液的去除率在15 d之前一直呈上升趋势，在15 d后开始下降。

2.4 蛋白核小球藻对沼液中总磷含量的影响

总磷含量变化曲线如图6所示，蛋白核小球藻对沼液中总磷的去除效果良好，18 d沼液中总磷含量仅为0.014 mg/L，去除率为99.72%。试验过程中总磷含量保持持续稳定下降。总磷含量的去除率持续上升，直至18 d时达到最大，去除率为99.72%。

2.5 蛋白核小球藻对沼液中铵态氮含量的影响

铵态氮含量变化曲线如图7所示，蛋白核小球藻对沼液中铵态氮的去除效果明显，尤其是在蛋白核小球藻生长的前6 d。最终在18 d时，铵态氮含量下降至2.790 mg/L，去除率为96.79%。可以看出在蛋白核小球藻生长前期铵态氮的去除情况相较于生长后期更为明显。铵态氮的去除率在9 d前呈快速上升趋势，之后进入平台阶段。

2.6 蛋白核小球藻对沼液中硝态氮含量的影响

硝态氮含量变化曲线如图8所示，可以发现培养过蛋白核小球藻的沼液中，硝态氮的含量有所增加，且在培养过程中保持上升趋势，但最终的硝态氮含量并非很高，为10.587 mg/L。

2.7 蛋白核小球藻对沼液中亚硝态氮含量的影响

亚硝态氮含量变化曲线如图9所示，亚硝态氮含量呈现出随着蛋白核小球藻的生长逐渐升高的趋势，18 d时亚硝态氮含量为39.337 mg/L，含量较高。

2.8 蛋白核小球藻对沼液中COD含量的影响

COD含量变化曲线如图10所示，蛋白核小球藻对沼液中COD含量的去除无明显效果。在试验过程中，COD含量处于波动状态，无明显规律。这表明蛋白核小球藻不能有效去除沼液中的COD。

3 讨论

3.1 沼液中蛋白核小球藻的生长特性

蛋白核小球藻的突出优势在于其能良好地适应沼液这一恶劣的生长环境，耐性较强；在其他藻种无法存活的条件下，蛋白核小球藻可以达到较好生长状态。且在生长过程中充分利用沼液中可被利用的营养物质，在生长的同时去除沼液中的营养物质，净化水质。这一结果与很多研究者[7-9]的研究结果相符。

3.2 沼液不同氮素形态的变化情况

由于微藻中的蛋白质、多糖、核酸等大分子物质都是由碳、氮、磷等元素组成，因此藻细胞的生长繁殖离不开氮、磷等元素的吸收，恰恰沼液中富含丰富的营养成分，正好为藻细胞的生长提供基本的养料[11]。其中氮源是微藻可利用的重要元素之一。

未经处理沼液中氮素的主要存在形式为铵态氮，在0 d时其含量远远高于硝态氮和亚硝态氮。经过蛋白核小球藻净化后的沼液，铵态氮含量明显下降，表明蛋白核小球藻在不同氮素存在形式中优先利用了铵态氮。本试验中铵态氮去除率为96.79%，优于陈香元[5]利用普通小球藻处理沼液的效果。在蛋白核小球藻生长的后期，硝态氮含量以及亚硝态氮含量逐渐上升，使得总氮含量在15 d之后又有所上升。这是由于亚硝态氮是藻体生长代谢过程中进行铵态氮氧化和硝态氮还原的中间产物，有部分铵态氮转化成为亚硝态氮。有研究表明较低浓度的亚硝态氮具有促进微藻生长的作用，但浓度升高会抑制藻类生长[12]，显然在蛋白核小球藻生长后期，亚硝态氮对其生长具有一定的抑制效果。

3.3 沼液中总磷的变化规律

有研究认为，磷是一切藻类都必需的营养元素，常被认为是第一位限制性营养元素[13]。本次试验中，经过蛋白核小球藻净化的沼液最终总磷含量为0.014 mg/L，达到了地表水环境质量标准（GB3838-2002）的Ⅰ类水总磷要求；对总磷去除率达99.72%，高于程海翔[6]利用栅藻处理粪水沼液的去除率，这说明蛋白核小球藻在总磷去除效果上优于栅藻。综上所述，沼液中的大部分磷元素可作为营养物质被蛋白核小球藻吸收利用。

3.4 蛋白核小球藻对沼液中COD含量的影响

目前国内有关藻类对沼液中COD去除的相关研究较少，这是由于藻类对于沼液中COD的去除效果一般。本试验旨在全面了解蛋白核小球藻净化沼液后水质变化情况，故测定了COD含量的变化曲线。推测COD含量的变化曲线呈现波动情况，可能是由于蛋白核小球藻生长过程中藻细胞的更新与代谢，造成了水体中有机物的不断变化。

4 小结

本试验证明了蛋白核小球藻可以在10%沼液稀释液中存活且具有较好生长状态。通过一株蛋白核小球藻对10%沼液稀释液为期18 d的净化，全面了解了沼液在净化过程中不同时期、不同指标的变化情况。在总氮、总磷、化学需氧量、铵态氮、硝态氮以及亚硝态氮的去除方面，蛋白核小球藻对总磷去除效果最好，其次为铵态氮、总氮。

综上所述，蛋白核小球藻可作为后续沼液净化的候选藻种；在微藻净化废水的同时资源化利用了其中的营养物质转化为其自身的生物量，是一种环境友好型的废水处理手段。这也为今后大容量藻类生物反应器的应用提供了理论依据，具有广阔的应用前景和现实意义。

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