食品中花生过敏原及其检测方法的研究进展

,,Lisa Wang,,*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)食品科学与工程学院,山东济南 250353;2.Harmoni International Spice,Inc.,881 S. Azusa Ave,City of Industry 91748,CA)

食品安全在民众生活中占有不容撼动的位置,与人民的生活息息相关。农兽药残留、食品添加剂的滥用、致病菌污染等食品问题对人体健康造成了极大的威胁。在众多食品问题中,食品过敏问题屡见不鲜。一些特殊体质的人极易对食品中的某些成分发生过敏反应,而这些过敏原很难从食品中去除掉,制约了食品的大范围流通,且对过敏患者的健康造成了严重威胁。目前食品过敏问题是食品行业较为严峻的问题。

1995年,联合国粮食与农业组织(FAO)认定了8种最常见的致敏食物,90%以上的食物过敏反应都是由它们引起的。因此,为了消费者的安全,一些发达国家在食品包装标签中强制要求标识过敏原成分[1]。我国针对这一现状,也出台了推荐在食品包装上标识致敏成分的条款。但是,目前在国际上还没有出台明确统一的对食品中主要过敏原限量规定的相关文件[2-4]。

花生是较常见的重要食物过敏原之一,会导致严重的过敏反应,并且热稳定性高、能耐酸和耐酶解,一般的生产方式无法去除花生食品的致敏性[5]。目前,正式命名的花生过敏原蛋白有11种,但是有些文献中也认为有13种,除了已经命名的11种花生蛋白之外,还有一种花生凝集素以及分子量为18 ku左右的油质蛋白[6]。随着经济的发展,食品的流通也趋于国际化,花生过敏问题也得到了广泛关注。本文主要介绍了酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹法、聚合酶链式反应(PCR)以及新兴的生物传感器和质谱法等对花生过敏原的检测。

1 花生过敏原的种类

1.1 Ara h 1

Ara h 1是最主要的花生过敏原,在花生过敏原中含量最多,约占总花生蛋白含量的12%～16%,属于豌豆球类蛋白,分子量为63.5 ku。花生过敏患者的血清90%以上都能够识别。在天然状态下有单聚体和三聚体两种,以可溶性蛋白的形式存在[7]。对于Ara h 1的三聚体形式,是疏水相互作用将三个单体连接起来形成的同源三聚体糖蛋白,具有很高的稳定性,并且可以耐受胃肠道的消化作用,加热也不会破坏其过敏性,因此具有很稳定的Ig E结合位点,不容易被破坏,过敏反应非常强[8]。同时,Cabanos等[9]经过研究,确定了Ara h 1三聚体结构的稳定性,并详细描述了其空间结构。Ara h 1中总共有23个线性Ig E结合位点,与豌豆蛋白相比有40%的相似性。

1.2 Ara h 2

Ara h 2属于蓝豆蛋白,也是主要的花生过敏原,含量约为花生蛋白总量的5.9%～9.3%,同样能够引起90%以上的过敏反应。Ara h 2包含Ara h 2.01和Ara h 2.02这两种遗传变异体[10],分子量范围在17～20 ku之间。在72～83号位点上,Ara h 2.02比Ara h 2.01缺失了12个氨基酸[11]。由于Ara h 2中二硫键较多,所以结构非常的稳定,并且耐酶解。如果二硫键被破坏,其水解敏感性将显著增加[12-13]。此外,Ara h 2具有抑制胰蛋白酶的特性,并且热处理能够提高抑制能力。但是如果二硫键被破坏,其抑制剂活性也随之降低。Ara h 2中共含有10个线性Ig E结合位点,并且易与Ara h 1、Ara h 3引起Ig E交叉反应[14]。

1.3 Ara h 3

Ara h 3的序列与大豆球蛋白有62%～72%的相似,因此属于大豆球蛋白,结构稳定。有Ara h 3.01 和 Ara h 3.02两个同种异形蛋白,分子量分别为60、37 ku[15]。44%以上的花生过敏患者的血清能够识别Ara h 3.01。Ara h 3.01可以水解成一个酸性和碱性的片段,再经过胰蛋白酶消化后,形成一些分子量在13～45 ku的片段,其中的IgE的结合位点可以导致过敏反应[16]。经过研究发现,Ara h 4与Ara h 3的氨基酸序列90%以上具有同源性,属于同源过敏原,而且线性IgE结合位点有4个相同的[17]。因此,Ara h 4被认为是Ara h 3的一种同种异形蛋白,并命名为Ara h 3.02,但是有些人又将两者统称为Ara h 3/4[18]。

1.4 其他

不同于以上3种花生过敏蛋白,其它几种花生过敏原的研究比较少,还没有详细的信息。其中,Ara h 5属于肌动蛋白,分子量为15 ku,肌动蛋白结合蛋白可以调节细胞内肌蛋白的结构,也可以被肌蛋白所调节;能抑制纤维形肌动蛋白的聚合作用[19-20]。Ara h 6和Ara h 7属于2S白蛋白,在花生中含量很低,与Ara h 2具有相似性,Ara h 6和Ara h 7与其分别有59%的同源性和35%的相似度,Ara h 6能够耐高温和酶解[21-23]。Ara h 6和Ara h 7的分子量都为15 ku,属于种子贮藏蛋白。Ara h 8属于病程相关蛋白,分子量17 ku,热稳定性差,不耐酶解[24]。Ara h 9是一种非特异性的脂转运蛋白,耐酶解、高温[25]。Ara h 10和Ara h 11分别属于16 ku油质蛋白和14 ku油质蛋白,主要来自于花生油脂[26]。Ara h 12的分子量有8、12、5.184 ku三种,Ara h 13同样有8、11、5.472 ku,属于防御素。

2 花生过敏原的检测方法

由于花生过敏患者只能通过不食用含有花生的食物来避免发生过敏反应,所以检测食品中花生过敏原蛋白含量的方法尤为重要。目前已经有检测花生过敏原的方法,如免疫学中的印迹法、酶联免疫吸附实验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)等,以及生物传感器、质谱法等其他检测方法。大多数用于检测过敏原的商业分析工具都依赖于免疫检测,如ELISA。然而,ELISA和PCR法基于蛋白质和基因水平上进行检测,虽然检测速度快,但是极易受到污染而出现假阳性的结果,从而限制了其应用。质谱法等仪器检测灵敏较高,可以省去繁琐的提取步骤,并且可以解决提取效率低的问题;还可以满足直接检测目标蛋白和变性蛋白的要求;避免了假阳性和假阴性的问题,使用同位素标记的特异性肽段作为内标,可以解决其基质干扰所带来的一系列问题。

2.1 ELISA

ELISA利用抗原抗体的特异性反应来检测花生过敏原,具有检测灵敏度高、特异性强、时间短的特点。ELISA法有夹心法、间接法和竞争法,其中常用双抗夹心和竞争法,且最低检测限为0.1～1 mg/kg。

双抗夹心ELISA既能检测抗体又能检测抗原,是一种常用的检测花生过敏原的方法。陈献雄等[27]使用双单克隆夹心法检测花生过敏原Ara h 1,得到了5 ng/mL的检测限,并且在5～80 ng/mL的范围内有良好的线性关系,同时对10种食物中的花生过敏原进行了检测,结果与标签标注基本相符,能够用于快速检测食品中的花生过敏原。Janssenduijghuijsen等[28]在调查影响花生食用后血清中过敏原检测的因素时,采用双单克隆夹心ELISA法检测花生主要过敏原Ara h 6的存在和数量。检测结果表明,该方法灵敏度很高,为使用ELISA方法检测食品中的花生过敏原提供了基础。目前,可以直接从市面上购买专门的ELISA试剂盒来进行花生过敏原的检测。最常用的有德国拜发、美国CORTEZ和上海甄准公司的试剂盒。

竞争ELISA是将具有专一性的抗体固著于酶标板上,然后加入待测样本,使其中的待测抗原与固着于酶标板上的抗体结合,然后加入辣根过氧化物标记的抗原,两种抗原竞争结合包被抗体,通过显色可以测定抗原。也可以使用该方法来测定抗体。闫飞[29]等使用ELISA检测了花生过敏蛋白Ara h 6,IC50为 414.6 ng/mL,在16.5～10000 ng/mL的范围内,有很好的线性关系,并且精确度和重复性很好。蛋白质经过加热之后一级结构会发生变化,导致检测过程中花生过敏原无法被抗体正确识别,出现假阴性。此外,花生过敏原与其他过敏原之间有较强的交叉反应,采用抗原抗体技术也会出现交叉反应,会出现检测值偏高和假阳性现象。

2.2 PCR法

PCR法是一种基于检测DNA/RNA的方法。一些花生过敏原虽然耐高温,但是在实际生产中经常要进行一系列的高温处理,会破坏过敏原的结构,而经过长时间高温高压的处理后在一定时间内DNA仍能保持完整,因此可以使用PCR法来直接检测花生过敏原基因。目前,在花生过敏原的检测中最常使用的两种方法是传统PCR和实时PCR,并且PCR法特异性强、灵敏度高、简便快速,对纯度要求比较低,DNA粗制品及RNA均可直接作为扩增模板。Dimitra等[30]采集了152份样品,采用实时PCR方法进行分析。结果表明,花生样品中有125份(83%)呈阳性,并且在84份未标明花生过敏原的样品中,48份(57%)呈阳性。因此,实时PCR技术是快速检测和定量食品过敏原的重要手段。在PCR实验中需要设计引物,来检测花生PCR靶基因序列,如果靶序列或引物太短,就容易出现假阳性,需要重新设计引物。并且实验过程中可能会出现DNA部分降解或完全降解,会导致假阴性的结果。此外,检测过程中还可能出现交叉污染。另外,Zhang等[31]采用复合引物技术设计了一个竞争性内扩增控制(IAC),建立了花生过敏原Ara h 1 DNA的实时PCR检测方法。方法的检出限为0.005%,表明该方法对食品中花生成分的检测具有较高的灵敏度。

目前由于使用PCR检测花生过敏原容易出现假阴性和假阳性的现象,对于PCR技术在检测花生过敏原的推广还具有一定的局限性。

2.3 印迹法

印迹法(blotting)是将样品转移到固相载体上,通过特定的探测反应来检测样品。印迹法分为免疫印迹和斑点印迹,一般使用斑点印迹和免疫印迹来检测花生过敏原,通常将两者结合起来共同检测。

免疫印迹(Western blotting)又称蛋白印迹,是一种分析蛋白质的常用技术,类似于ELISA,都属于免疫标记技术。利用SDS-PAGE,将蛋白质作为被检测物,抗体作为“探针”,用标记的二抗“显色”。首先通过SDS-PAGE电泳将待测蛋白分离,然后胶上的蛋白通过电场力的作用转移到固相载体,两者以非共价键的形式结合,并且电泳分离的多肽类型及其生物学活性保持不变。该方法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。Yapo-Crezoit等[32]采用SDS PAGE法和Western blots法两种方法,对两份花生种子进行了蛋白质图谱分析,并结合Western blots对花生种子进行了蛋白质分析。在花生种子的提取物中,发现了致敏蛋白Ara h 1(63.5 ku)、Ara h 2(17,20 ku)和Ara h 3(25、36、40和44 ku)的可见指纹,以及Ara h 3约36 ku的致敏带,这为花生中主要过敏原的存在提供了证据。Wu等[33]采用免疫印迹鉴定了纯化的Ara h 2,其纯度可以达到90%,是一种很好的检测花生过敏原的方法。

胶体金免疫层析法以胶体金为标记物,利用抗原抗体反应进行检测的新型免疫标记检测技术。同ELISA一样,具有3种检测方式。主要是将胶体金本身的显色特点与免疫层析技术相结合,进行特异性的检测。刘悦[34]建立了一种具有高灵敏度的胶体金免疫层析试纸条。能同时检测3种过敏原。并且检测结果与试剂盒同步、操作简单、用时较短并能实现高通量的检测。为了提高方法的灵敏度,今后可使用单克隆抗体,并且采用上转换材料、荧光量子点等新型材料作为标记物进行替代。

2.4 生物传感器法

生物传感器发展很快,种类众多,并且逐渐应用到食品的领域中,在花生过敏原蛋白的检测中最常使用的是免疫传感器和光传感器。免疫传感器是利用抗原与抗体特异性反应而导致检测装置信号变化设计而成的一种传感器,将传统的免疫测试和生物传感技术融为一体,具有灵敏度高、选择性强、检测限低、检测速度快的特点。而且分析过程简单,易于操作,测量过程自动化。Montiel等[35]用磁免疫传感器成功检测了食品中的花生过敏原Ara h 2,在87～10000 pg/mL的范围内有良好的线性关系,检测限为26 pg/mL,比其它非标蛋白有更好的选择性。该方法成功检测了小麦食品中添加的花生过敏原,检测限低达5 mg/kg,并且能够成功的应用到不同的提取食物中花生过敏原的检测。

光敏材料种类繁多,并且有较为广泛的发展。由于适配体易于修饰和控制,不存在明显的失活现象,已成为生物传感器中分析配体的有效分子识别元件。荧光标记适配体可用于分子识别的光学传感器中。Weng等[36]开发了一个微流控系统,该系统集成了量子点适配体修饰的氧化石墨烯纳米生物传感器,用于简单、快速、灵敏的检测食品中的过敏原。该生物传感器利用量子点-适配体-氧化石墨烯配合物作为探针,在与食物过敏原相互作用时发生构象变化,通过对适配体的吸附和解吸,使氧化石墨烯的荧光猝灭和恢复性能发生荧光变化。在这种现成的微流控芯片中,仅用10 min就实现了对花生中主要过敏原Ara h 1的定量检测。结果表明,该体系具有显著的灵敏度和选择性。将微流控平台集成到自制微型光学分析仪中,为食品过敏原的快速、经济、准确的现场检测提供了一种有前景的方法。并且该生物传感器选择相应的适体还可用于检测其他食物过敏原。

虽然传感器检测存在制作复杂、电极用于样品检测次数有限等不足。随着技术水平的不断提高,各种新型材料应用与传感器中能够逐渐弥补这些缺陷,在未来的食品检测中具有较大的应用前景。

2.5 质谱法

因为缺乏花生过敏原的标准品,所以对于直接使用仪器检测花生过敏原的文献并不多。在这种情况下,利用传统的仪器法建立对花生过敏原定量和定性的检测方法非常困难。

传统的应用于分离蛋白质的方法主要有液相色谱法和毛细管电泳法。但是花生蛋白虽然种类颇多,但是理化性质极为相似,使用上述方法进行检测常会出现基线无法分离的情况,一些极为相似的蛋白质甚至根本无法分离。而蛋白质中的氨基酸具有各种遗传变异体,它们的保留时间不尽相同,在检测过程中出现多重峰,导致检测难度增加。由于蛋白质在紫外检测器280 nm的波长下都能达到最大吸收,所以经常使用这两种方法在该波长下进行检测。但是在280 nm处,基质中的干扰物质也能被吸收。导致这两种传统的方法特异性比较差,灵敏度也很差,只有5～15 μg/mL的检测限。因此,对于食品中微量或痕量的蛋白质的检测来说该方法并不适用。

为了弥补上述不足,通常采用质谱法进行检测。质谱检测器是根据不同蛋白质的质荷比不同将其分离。电喷雾电离后的蛋白质因为流动相pH、仪器等因素不同呈现多电荷分布。质谱法种类颇多,不同的仪器应用方法及特点都不同。目前主要采用LC-MS/MS和ICP-MS来进行花生检测。

液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)是将复杂样品经过液相色谱分离后,再用质谱仪进行检测定性的技术。将两者的分离功能和定性功能结合起来,对于复杂的混合物也可以很好地进行定性和定量。并且简化了样品的前处理过程,能够快速检测样品,操作也比较简单。Daly[37]等采用质谱法对杏仁和花生的两种不同的ELISA试剂盒的检测结果进行了验证,证明了杏仁阳性检测结果是由于交叉反应所致。此法成功检测了花生蛋白,并且能够弥补ELISA法交叉反应导致假阳性的问题,表明此方法具有很好的发展前景。Shefcheck等[38]从巧克力中直接提取蛋白,经过胰蛋白酶进行消化,再使用LC-MS/MS定性检测,成功检测到了花生过敏原Ara h 1,检测限达到10 mg/kg。

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)在检测时先由氩气将样品引入雾化系统进行雾化,然后样品以气溶胶形式进入等离子体中心区,在高温和氩气环境中样品发生去溶剂化、汽化解离和电离,被转化成正离子后经离子采集系统进入质谱仪,各肽段因为质荷比不同而分离,各元素含量通过元素质谱峰强度来确定。Careri等[39]采用此法与LC-MS/MS法检测Ara h 2和Ara h 3/4,检测限分别为5、1 μg/g,并且在10～200 μg/g的范围内有良好的线性关系。ICP-MS与LC-MS/MS相比,ICP-MS的灵敏度相对较好,但ICP-MS仍有一定的局限性,还有待改进[40]。

现如今,质谱由于具有灵敏度高、分析速度快、样品用量少、能同时进行分离和鉴定等特点,已经广泛用于检测花生过敏原。但是由于对样品和操作的要求比较高,仪器比较昂贵使得其应用受到限制。

3 结论与展望

本文从蛋白质和DNA的检测水平综述了多种检测花生过敏原的方法。但是这些方法还存在着些许不足,无法达到准确的定量结果。食品加工过程中经常使用的加热过程,会导致花生过敏原的一级结构被破坏,使得直接检测花生过敏原蛋白的ELISA法和SPR法出现假阴性。此外可以通过加工工艺将过敏原的DNA片段从食品中完全分离出去,使得直接检测过敏原DNA的PCR法也无法准确检测出花生过敏原。同时,对于热变性蛋白传统的仪器法也无法检测,存在一定的局限性。因此,需要建立一种能直接检测致敏蛋白和变性蛋白的方法,用于食品中的花生过敏原的定量测定。针对以上问题,就目前存在的技术来说,电化学传感技术和液质联用是一个比较有发展前景的方法。而现如今,上转换材料、荧光量子点、碳点等新型材料的广泛使用也给电化学传感器、免疫印迹等方法提供了新的研究方向。这些新型材料与目前存在的技术相结合,能够逐渐弥补目前检测方法存在的不足,为食品中花生过敏原的检测提供了广阔的发展前景。